Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов

Билирубин мешает определению уробилиноидов, поэтому, если он обнаружен в моче, его следует предварительно удалить, осаждая хлоридом бария с последующим фильтрованием. Для этого к 10–12 мл мочи приливают 5–6 мл 10%-ного раствора ВаСl2 и фильтруют. Затем фильтрат проверяют на полноту осаждения билирубина и процедуру повторяют, если первое осаждение было неполным.

Унифицированный метод с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода

Уробилиноген с парадиметиламинобензальдегидом образует комплекс, окрашенный в красный цвет; интенсивность окраски пропорциональна содержанию уробилиногена. Для восстановления уробилина в уробилиноген используют аскорбиновую кислоту и гидрат окиси железа. Для увеличения специфичности реакции добавляют ацетат натрия.

Необходимые реактивы

1. 4-диметиламинобензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).

2. НСl концентрированная; реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтоватым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

3. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH3COONa × 3H2O (или 226 г CH3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °С. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

4. Аскорбиновая кислота.

5. Натр едкий, 0,5 г/л раствора.

6. Бария хлорид, 100 г/л раствора.

7. Фенолсульфофталеин (феноловый красный). Используют для приготовления калибровочного раствора.

8. Основной калибровочный раствор: 20 мг фенолсульфо-фталеина растворяют в 100 мл 0,5 г/л раствора едкого натра. Стабилен при хранении.

Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора 0,5 г/л раствором едкого натра в 100 раз. Стабилен в течение недели с условием хранения при 20 °С.

Рабочий раствор содержит 0,2 мг фенолсульфофталеина в 100 мл и эквивалентен по окраске раствору уробилиногена – 0,345 мг на 100 мл. Точность приготовления можно проверить измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре: при длине волны 562 нм оптическая плотность раствора должна быть 0,380–0,390.

Специальное оборудование – фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

Исследование проводят в первые 2–3 ч после мочеиспускания. При наличии мутности мочу центрифугируют, а затем проводят качественное определение билирубина. Если обнаруживают билирубин, то 8 мл мочи смешивают с 2 мл 100 г/л раствора хлорида бария и фильтруют через бумажный фильтр. Конечный результат умножают на 1,25, чтобы внести поправку на разведение.

Ход исследования

100 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 10 мл исследуемой мочи и помещают по 1,5 мл в 2 пробирки для опытной и холостой пробы. В пробирку с холостой пробой прибавляют 4,5 мл свежеприготовленной смеси одного объема раствора Эрлиха и двух объемов насыщенного раствора ацетата натрия.

В пробирку с опытной пробой прибавляют 1,5 мл раствора Эрлиха и немедленно приливают 3 мл насыщенного раствора ацетата натрия. Через 5 мин измеряют экстинкцию обеих проб против воды на фотоэлектроколориметре при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см, на спектрофотометре при длине волны 562 нм.

Рабочий калибровочный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Результаты выражают в единицах Эрлиха (1 ед. соответствует 1 мг уробилиногена). Концентрацию уробилиногена выражают количеством единиц Эрлиха в 100 мл мочи (Едэ).

Расчет производят по формуле:

Едэ = Ео – Еx / Ек × 0,346 × 6,0 / 1,5 = Ео – Еx / Ек × 1,38,

где Ео – экстинкция опытной пробы;

Ех – экстинкция холостой пробы;

Ек – экстинкция калибровочной пробы;

0,346 – концентрация уробилиногена в растворе (0,346 мг на 100 мл), окраска которого эквивалентна окраске калибровочного раствора фенолфталеина;

6,0 – объем пробы, мл;

1,5 – количество мочи в пробе, мл. Соотношение ингредиентов при определении уробилиногена в моче представлено в таблице 36.

Таблица 36

Соотношение ингредиентов (в мл) при определении уробилиногена в моче

Рекомендуется собирать мочу в посуду из темного стекла, так как при дневном свете окисление уробилиногена происходит значительно быстрее.

Для Расчета выделения уробилиногена за определенное время для исследования надо брать мочу из всего собранного за это время объема и, учитывая его, провести Расчеты по формуле:

Ео – Еx / Ек × 1,38 × V / 100,

где V – объем мочи, мл, выделенный за определенный промежуток времени;

1/100 – коэффициент для Расчета количества уробилиногена в 1 мл мочи.

Определение порфобилиногена

Унифицированный метод с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода

Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с парадиметиламинобензальдегидом с образованием окрашенного в красный цвет соединения. Для повышения специфичности реакции добавляют ацетат натрия. Соединения, дающие аналогичную реакцию с парадиметиламинобензальдегидом (уробилиноген, производные индола, скатола и др.), удаляют путем экстракции хлороформом и бутанолом, в которых ПБГ нерастворим.

Необходимые реактивы

1. 4-(диметиламино)-бензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).

2. Соляная кислота концентрированная.

3. Реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

4. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH3COONa × 3Н2О (или 226 г CH3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °С. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

5. Хлороформ.

6. Бутиловый спирт.

7. Бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0–5,0).

Ход исследования

Исследуют мочу в первые 2–3 ч после мочеиспускания. Смешивают в пробирке 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают. Измеряют рН индикаторной бумагой; рН должен быть в интервале 4,0–5,0.

Если рН меньше 4,0, то добавляют раствор ацетата натрия до установления нужного рН. Если окраска не развивается, результат считают отрицательным. При развитии розовой или красной окраски к пробе добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний слой остается бесцветным или слегка желтоватым, то результат следует считать отрицательным. Если окраска остается в слое над хлороформом, то 6–8 мл из окрашенного слоя переносят в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 1 : 2 и встряхивают. Если фазы не сразу разделяются, то смесь центрифугируют при переходе окраски в слой бутилового спирта – результат отрицательный, если же окраска остается в исследуемом слое, то в исследуемой моче концентрация ПБГ превышает нормальную.

Если концентрация ПБГ в моче нормальна (до 2 мг/л), то проба отрицательная. ПБГ данным методом обнаруживают при концентрации выше 6 мг/л.

При хранении мочи более 3 ч при комнатной температуре