Медицинская паразитология с энтомологией - Сергей Павлович

В сопроводительном листе, прилагаемом к пробам, должны быть указаны фамилия, инициалы больного или умершего, материал, цель исследования, название направляющего пробы учреждения, адрес лаборатории, куда они доставляются, и дата.

При микробиологическом исследовании материалов нужно строго соблюдать правила противоэпидемического режима, исключающие возможность внутрилабораторного инфицирования, и, прежде всего, неукоснительно выполнять рекомендации по предотвращению заражения вирусами гепатитов и СПИДом.

Выделение чистых культур

Чистая культура – это биомасса одинаковых особей микроорганизмов (колонии), полученных на питательной среде из патологического материала, глубокое исследование которой позволяет установить видовую принадлежность возбудителя и природу инфекционного заболевания.

Приступая к выделению чистой культуры, следует иметь в виду, что возбудители в экскретах находятся в ассоциации с банальной (посторонней) микрофлорой. Для их изоляции гной,

мокроту, осадок мочи, испражнения необходимо засеять так, чтобы получить изолированные колонии. С этой целью они засеваются частыми штрихами бактериальной петлей по всей поверхности агаризованных сред в чашках Петри. Взятые тампонами слизь из зева, смывы с рук и предметов засевают на пластинчатые среды круговыми движениями или тампоны вначале отжимают в жидких средах с последующим штриховым отсевом бактериальной петлей.

Выросшие колонии после детального изучения пересевают на скошенные и жидкие среды. Накопив в них биомассу чистой культуры, на I этапе идентификации вида исследуют ее морфолого-культуральные свойства.

Окончательное определение видовой принадлежности выделенной культуры осуществляют на II этапе идентификации после всестороннего исследования: 1) спектра ферментов; 2) антигенной и генотипической структуры микроорганизмов с помощью диагностических иммунных сывороток, ДНК-зондирования и полимеразной цепной реакции.

Иммунологические сдвиги при протозойных инвазиях

Патогенные протесты имеют сложную антигенную структуру и содержат гораздо больший набор антигенов, чем бактерии. Организм больного человека реагирует на антигены протестов развитием разнообразных гуморальных и клеточных защитных реакций, но эффективность их при разных инвазиях неодинакова, что зависит от вида и локализации паразита в организме.

Так, при паразитемиях (развитие простейших в крови) вырабатывается большое количество паразитоцидных иммуноглобулинов, однако полной элиминации циркулирующих в крови простейших они не вызывают. Под их влиянием у части простейших быстро развивается изменчивость антигенной структуры. К таким паразитам, например, можно отнести африканские трипаносомы и малярийные плазмодии. Дизентерийные амебы, жиардии, трихомонады – слабые иммуногены. В ответ на их воздействие организм продуцирует невысокий титр антител. Столь же ограничена индукция клеточных иммунных реакций.

Паразитирующие в спинномозговой жидкости и головном мозге простейшие и гельминты иммунологических реакций не вызывают. Более того, такая локализация защищает их от паразитоцидного действия иммуноглобулинов, фагоцитов и цитотоксических лимфоцитов.

При протозойных инвазиях и гельминтозах могут быть использованы все иммунологические реакции, но чаще всего, – реакция иммунофлюоресценции, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации и иммуноферментный анализ, которые, однако, часто оказываются недостаточно специфичными вследствие медленного нарастания антипротозойных и антигельминтных иммуноглобулинов или низкого их титра. В отличие от этого при паразитарных болезнях в крови закономерно нарастает титр аллергических иммуноглобулинов.

Серологические реакции в диагностике протозойных инвазий и гельминтозов

Современная иммунология разработала большой комплекс простых и очень точных иммунологических реакций, широко используемых не только в диагностике инфекционных болезней и инвазий, но также при оценке иммунологической реактивности организма, аллергии, аутоиммунных и других иммунопатологических процессов.

Серологическими называют такие реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела. В их основе лежит специфическое взаимодействие антитела с антигеном.

Серологические реакции применяют: а) для идентификации микроорганизмов, токсинов, любого антигена с помощью известных иммунных диагностических сывороток; б) для определения природы антител в сыворотке крови с помощью известных антигенов-диагностикумов. При этом метод определения видовой принадлежности (идентификация) микробов называют серологическим типажем, а способ определения титра антител в сыворотке крови – серологической диагностикой.

Основными серологическими реакциями являются традиционные реакции агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, нейтрализации и различные их модификации.

Общие закономерности серологических реакций: 1) реакции ставятся in vitro; 2) проявляются при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела, в оптимальных температурных условиях и pH среды; 3) протекают в две фазы: а) взаимодействие антигена с антителом – специфическая фаза; б) образование комплекса антитело – антиген – неспецифическая фаза.

Иммунные диагностические сыворотки получают путем многократного введения животным в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов (паразитов), продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов.

После определенного цикла иммунизации животных делают пробное кровопускание (2–3 мл) и определяют титр сыворотки. Если в сыворотке содержится достаточное количество антител, делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37 °C на 4–6 ч для ускорения свертывания, затем – в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты (мертиолят, хинозол), определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки.

Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но они способны давать групповые (перекрестные) реакции. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью действия, но имеют низкий титр антител – от 1:40 до 1:320.

К диагностическим сывороткам относятся: 1) агглютинирующие сыворотки, применяемые для определения рода, вида и серовара микроорганизмов; 2) преципитирующие сыворотки, предназначенные для выявления высокодисперсных антигенов и токсинов; 3) гемолитическая сыворотка, используемая в реакции связывания комплемента; 4) антитоксические сыворотки, нейтрализующие токсины; 5) антивирусные сыворотки. Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов-диагностикумов в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых микробов, продукты их расщепления и токсины. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

В основе проявления всех серологических реакций лежит образование иммунных комплексов, регистрируемых невооруженным глазом или с помощью лупы, микроскопа, специальной аппаратуры (например, агглютиноскопа, спектрофотометра, счетчика излучений) или индикатора.

Традиционные серологические реакции

Реакция агглютинации

Агглютинацией называется склеивание микробов (клеток) при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Реакцию агглютинации (РА) используют в серо-типаже микроорганизмов, главным образом бактерий, и в серодиагностике инфекционных болезней. Для ее постановки необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин); 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

В качестве антигена в РА применяют свежевыросшую взвесь живых или убитых формалином, спиртом, нагреванием культур (диагностикумов).

Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2–7 сут в возрастающих дозах вводят убитые бактерии. Заканчивают курс иммунизации животных 2–3 инъекциями живых бактерий. Через неделю определяют титр сыворотки – максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают.

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения их вида надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его как минимум до половины титра.