Медицинская паразитология с энтомологией - Сергей Павлович

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения их вида надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его как минимум до половины титра.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости их сильно разводить.

Развернутая РА для серотипажа микробов. Ее ставят следующим образом: в агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл неадсорбированной сыворотки, разведенной 1:100, и, перемешав, 1 мл переносят во вторую, из второй – в третью и т. д. Получив двукратные разведения диагностической сыворотки от 1:100 до 1:1600 и более, вносят в них по 1–2 капле 2-миллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °C, затем осуществляют предварительный учет, начиная с контролей.

Отсутствие агглютинации в контроле и наличие взвешенных хлопьев в 2–3 и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции (рис. 3). Окончательные результаты учитывают через 18–20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре.

Рис. 3. Развернутая реакция агглютинации

Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++», «++», «+» – убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка.

Заостряя внимание на агглютинате, следует указать, что для обнаружения неорганизованных антигенов простейших и гельминтов используют латекс-агглютинацию, адсорбируя их видовые иммуногены или гаптены на латекс-частицах, которые, реагируя с антителами, склеиваются в виде мелкозернистых осадков, какие образуются, например, при агглютинации мельчайших бактерий и риккетсий.

Развернутая РА для серодиагностики инфекционных болезней. Обнаружение в сыворотке больных антител к определенным видам микроорганизмов – косвенный, но очень важный показатель, так как они образуются только под воздействием возбудителя заболевания. Техника постановки развернутой РА для серодиагностики такая же, как в серотипаже. Получив сыворотку больных, ее, как и диагностическую, разводят изотоническим раствором натрия хлорида от 1:100 до 1:1600.

В качестве антигена в этой реакции используют диагностику-мы – заведомо известные взвеси убитых бактерий, с которыми безопасно работать.

Учитывается она так же, как развернутая РА для идентификации бактерий. Обычно клинический диагноз подтверждает наличие агглютината в титре 1:200 и выше. При агглютинации бактерий в более низких титрах сыворотки, что может происходить за счет нормальных антител, имеющихся у здоровых людей или больных другим заболеванием, реакцию агглютинации ставят повторно спустя 3–4 дня с расчетом выявления нарастания титра антител. Нередко динамику нарастания антител прослеживают с самого начала заболевания, для чего исследуют «парные» сыворотки, полученные от больного в разгар заболевания и спустя 7-10 и более суток, когда титр агглютининов под воздействием патогенного микроба повышается в 2–4 и более раз.

В тех случаях, когда в качестве антигена предполагается использовать мельчайшие микроорганизмы, например микоплазмы и вирусы или экстракты и лизаты бактерий, другие высокодисперсные вещества, комплексы которых с агглютининами увидеть невозможно даже в агглютиноскопе, прибегают к постановке реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), сорбируя их на бараньих эритроцитах. Ставится она в лунках полистироловых планшет. По чувствительности и наглядности результатов намного превосходит развернутую РА.

РИГА для серодиагностики инфекционных болезней и инвазий. Для обнаружения антител в сыворотках больных готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого бараньи эритроциты в течение 15 мин обрабатывают раствором таннина в разведении 1:20 000-1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют 2 ч при температуре 37 °C. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают 0,85 %-ным раствором натрия хлорида и в объеме 0,1–0,25 мл 0,5 %-ной взвеси добавляют к сыворотке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25-0,5 мл в лунки планшет (рис. 4).

В качестве контроля используют взвеси интактных и нагруженных специфическим антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо отрицательную и положительную реакции.

Рис. 4. РИГА для серодиагностики инфекционных болезней: Эр. Аг – эритроцитарно-антигенный диагностикум; Ат – антитела

Результаты учитывают через 2 ч после инкубации в термостате. Оценивают РИГА плюсами: «++++» – эритроциты равномерно покрывают всю лунку планшеты в виде зонтика с неровными краями; «+++», «++» – осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеившихся эритроцитов; «+» – в основном видны не склеившиеся эритроциты.

Рис. 5. РИГА для выявления высокодисперсных антигенов: Эр. Ат – эритроцитарно-антительный диагностикум; Аг – антигены

При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде плотного диска («пуговицы») на дне лунок.

РИГА для идентификации високодисперсних антигенов. Для определения видовой принадлежности антигенов готовят антительный диагностикум, сорбируя на эритроцитах иммуноглобулины известной иммунной сыворотки. Параллельно в лунках полистироловых пластин делают двухкратные разведения антигена в объеме 0,25-0,5 мл и к каждому из них добавляют 0,1–0,25 мл сенсибилизированных антителами эритроцитов (рис. 5). Учет и оценка антительной РИГА для идентификации антигенов производится в те же сроки и по тем же показателям, которые используются в аналогичной ей реакции для серодиагностики болезней.

Реакция преципитации

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора антигена (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых количествах, которые не обнаруживаются в химических реакциях.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические частицы белково-полисахаридной природы, экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада бактериальных клеток, их лизаты, фильтраты патологического материала. Так как преципитиногены обладают термоустойчивостью, то для их извлечения материалы подвергаются кипячению. В РП используются жидкие и прозрачные антигены.

Преципитирующие сыворотки обычно получают путем гипериммунизации кроликов в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Титр преципитирующей сыворотки в отличие от титра других диагностических сывороток определяется максимальным разведением антигена, который преципитируется в ней. Это объясняется тем, что преципитиноген, участвующий в РП, содержит в единице объема гораздо больше частиц, чем содержится антител в преципитирующей сыворотке такого же объема. В связи с этим преципитирующие сыворотки выпускают с титром не ниже 1:100 000.

Реакция кольцепреципитации Асколи. В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведен-ной преципитирующей сывороткой в объеме 0,5–1 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена. Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости.

Рис. 6. Реакция преципитации: а – реакция Асколи: 1 – опыт;2 – контроль; б – реакция Оухтерлони: 1 – специфическая иммунная сыворотка; 2 – нормальная сыворотка;3 – известный антиген; 4 – неизвестный антиген

Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1–2 ч или через 20–24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета (рис. 6, а). Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.