Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов
Шрифт:
Интервал:
Закладка:
Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты); если есть способ измерить интенсивность коагуляции, то проба становится количественной.
Унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой
Необходимый реактив
20%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.
Ход исследования
В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку прибавляют 6–8 капель реактива. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, пробу считают положительной.
Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют 2–3 каплями 10%-ного раствора уксусной кислоты.
Унифицированный метод Брандберга—Робертса—Стольникова
В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция, в результате чего появляется белое кольцо.
Необходимый реактив
30%-ный раствор азотной кислоты (относительная плотность 1,2) или реактив Ларионовой. Приготовление реактива Ларионовой: 20–30 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты.
Ход исследования
В пробирку наливают 1–2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают такое же количество профильтрованной мочи. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2 и 3-й минутами указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т. е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком – в 4 раза, при компактном – в 8 раз и т. д. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на 1 л (г/л).
Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца уратное появляется немного выше границы между двумя жидкостями и растворяется при легком нагревании.
Количественное определение белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты
Принцип метода
Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.
Необходимые реактивы
1. 3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.
2. 0,9%-ный раствор хлорида натрия.
3. Стандартный раствор альбумина – 1%-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором.
Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев.
Специальное оборудование – фотоэлектроколориметр.
Ход исследования
В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм.
Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице 34.
Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают так, как опытные пробы.
Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при Расчете.
Таблица 34
Приготовление разведений для построения калибровочного графика
Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и высокими концентрациями в моче мочевой кислоты.
Биуретовый метод
Принцип метода
Пептидные связи белка с солями меди в щелочной среде образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.
Необходимые реактивы
1. 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 20%-ный раствор меди (CuSO4 × 5H2O).
3. 3%-ный раствор NaOH.
Ход исследования
К 5 мл мочи, взятой из суточного количества, прибавляют 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок затем растворяют в 5 мл раствора NaОН. К раствору добавляют 0,25 мл CuSO4, смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочной кривой, при построении которой на оси ординат откладывают концентрацию белка (г/л), а на оси абсцисс – оптическую плотность в единицах экстинкции. По полученной концентрации рассчитывают суточную потерю белка с мочой.
Белок может быть обнаружен с помощью индикаторной бумаги (полосок).
Принцип основан на феномене так называемой протеиновой ошибки некоторых кислотно-щелочных индикаторов. Индикаторная часть бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером. При увлажнении бумаги буфер растворяется и обеспечивает соответствующий рН для реакции индикатора. При 3,0–3,5 аминогруппы белков реагируют с индикатором и меняют его первоначально желтую окраску на зеленовато-синюю, после чего, сравнивая с цветной шкалой, можно ориентировочно оценить концентрацию белка в исследуемой моче. Основной предпосылкой правильной работы индикаторных полосок является обеспечение pH в диапазоне 3,0–3,5 для протекания реакции. Если бумага находится в контакте с исследуемой мочой дольше экспозиции, указанной в инструкции, то цитратный буфер в ней растворяется, и тогда индикатор реагирует на истинный рН мочи, т. е. дает ложноположительную реакцию. В связи с тем что емкость буфера ограничена, то даже при соблюдении методических указаний в пробах слишком щелочной мочи (pH > 6,5) получаются ложноположительные результаты, а в пробах слишком кислой мочи (рН < 3,0) – ложноотрицательные. Число
