Нейротон. Занимательные истории о нервном импульсе - Александр Иванович Волошин

при заполнении аксона искусственным раствором с концентрацией К+ аналогичной аксоплазме, на мембране возникал обычный потенциал покоя.

При одинаковой концентрации калия внутри волокна и в наружной среде, потенциал покоя в полном соответствии с формулой Нернста не возникал. Если же в аксон закачать обычную морскую воду, и поместить его в среду с высокой концентрацией калия, то полярность потенциала покоя меняется на противоположную; при этом величина потенциала соответствует формуле Нернста.

Эти эксперименты доказывали решающую роль мембраны в возникновении потенциала покоя – ведь протоплазма со всеми органеллами и белковыми молекулами попросту отсутствовала. Фактически подтверждена мембранная теория Бернштейна. Кстати, сегодня учёные научились создавать и искусственные мембраны. То есть можно исследовать ситуацию, в которой белковые насосы и каналы отсутствуют в мембране. Такая «искусственная клетка» продолжает вести себя как живая.

А в недалёком 1986 году Ходжкин продемонстрировал ещё один показательный эксперимент. Он искусственно создавал разрыв электролита в окружающей нервное волокно среде, что приводило к прерыванию нервного импульса.

Схема этого опыта такова. Средний участок нерва помещали в не проводящую электричество среду (наливали масло в среднее отделение ванночки). Как и ожидалось, возбуждение доходило только до этого участка и прерывалось.

Представляет интерес вторая часть опыта: жидкости в первом и третьем отделениях соединяли обыкновенной медной про́волочкой, при этом импульс, исчезнув на втором отрезке, появляется опять на конечном участке. Очевидно, что про́волочка служит проводником электрического тока замыкая электрическую цепь. (Хотелось бы увидеть продолжение эксперимента – не изолировать часть аксона в масле, а перерезать и соединить его части проводком.)

Рисунок 48. Эксперимент Ходжкина с разрывом электролита

Казалось бы, всё, этот опыт доказывает чисто электрический характер передачи сигнала вдоль волокна. Но…

Давайте заменим масло на другой хороший диэлектрик – воздух. Впервые ещё Н. Е. Введенский продемонстрировал, способность нерва сохранять способность к проведению возбуждений при длительном (около 8 часов) раздражении в атмосфере воздуха. Даже при помещении нерва в атмосферу азота способность нерва к проведению некоторое время сохраняется, хотя и быстро падает.

Что же касается масла, то теперь-то мы знаем, что мембрана нейрона состоит из липидов – жироподобных молекул, может в этом секрет описанного опыта?

Пейсмекерные нейроны

Кроме нейронов, суммирующих и передающих информацию к другим клеткам, описаны так называемые пейсмекерные нейроны, способные самостоятельно генерировать электрические импульсы (Alving, 1968). Активность таких нейронов характеризуется синусоидальными колебаниями частотой 0,1—10 Гц и амплитудой 5—10 мВ. Эти нейроны при отсутствии любого внешнего воздействия обеспечивают периодическую генерацию ПД и передачу возбуждения другим нейронам.

Эндогенные процессы подобных нейронов приводят к периодическому изменению ионной проницаемости мембраны и генерированию ПД. Предполагается, что, взаимодействуя с другими клетками, они синхронизируют их активность.

Дендритный спайк

С момента появления мембранно-ионной теории считалось, что потенциал действия проявляется исключительно в аксоне1, однако, со временем накопилось достаточно много аргументов в пользу того, что потенциалы действия присутствуют и в дендритах. Такие дендритные потенциалы, чтобы подчеркнуть их отличие от аксонных, стали называть «дендритными спайками».

Вплоть до 1950-х и ранних 1960-х годов господствующим было представление, что дендриты, вообще, являются пассивными отростками нейронов. При таком подходе интересная получалась схема – активными были только со́ма (тело) нервной клетки и аксон. Аксон, в свою очередь, может быть либо входом, либо выходом клетки как информационной единицы. То есть нервный импульс либо приходил ниоткуда, либо шёл в никуда.

В 1951 году впервые зафиксировал ПД в дендрите выдающийся китайский нейрофизиолог Чжан Сянтун (1907—2007). В опубликованной в том же году статье он сообщил о том, что и дендриты способны возбуждаться под воздействием электрической стимуляции и генерировать потенциалы действия, которые отличаются от аксонных тем, что не подчиняются правилу «всё или ничего». Поначалу, большинство нейробиологов отнеслись к его открытию критически, по-прежнему полагая, что аксоны являются исключительным участком нейрона способным к генерации потенциала действия.

Вскоре после Чжана, и другими учёными были получены доказательства относительно генерации дендритами спайков.

И только с конца 1980-х – начала 1990-х учёные начали повсеместно приходить к мысли, что дендриты не только передают информацию, но и меняют, и хранят.

Наиболее убедительно существование дендритных спайков было описано Грегом Стюартом и Бертом Закманом в период 1993—1998 годов, которые использовали для регистрации дендритного спайка цело-клеточные patch clamp электроды.

Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)

Метод двухэлектродной фиксации потенциала (1947 г.), с помощью которого Ходжкин и Хаксли сделали своё открытие даёт представление лишь об усреднённой активности многих тысяч ионных каналов на поверхности одного аксона. Вот если бы можно было использовать один электрод, настолько маленький, чтобы записать ток с одиночного ионного канала? Эта фантазия воплотилась в методе patch clamp (дословно – зажим напряжения) – методе локальной фиксации потенциала.

Рождению этого метода предшествовали опыты Альфреда Стрикхольма, выполненные в начале 1960-х. В них он использовал в качестве микроэлектродов стеклянные канюли с диаметром отверстия в несколько микрометров

Прижимая кончик такого стеклянного капилляра к мембране мышечного волокна, Стрикхольму удалось обеспечить электрическую изоляцию участка мембраны, попадавшего внутрь кончика пипетки.

В конце семидесятых годов XX века Эрвин Неер (E.Neher) и Берт Закман (B.Sakmann) предложили метод patch clamp – в основе которого использование супертонких стеклянных микроэлектродов, диаметр концевого отверстия которых составляет 1—2 мкм. В такую пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Если кончик такой пипетки совершенно гладкий и чистый, он плотно прилипает к мембране при контакте с клеткой, образуя изолированное для электрических токов соединение так называемый «гигаомный контакт». Часть мембраны, покрытая таким капилляром, называется patch и имеет площадь менее 10 мкм2. Значит велика вероятность, того что на нём может оказаться один единственный ионный канал. Подобная конфигурация называется cell-attached patch-clamp и позволяет записывать ионные токи, проходящие через конкретный канал, накрытый пипеткой.

1 Предполагалось, что преобразование постсинаптического потенциала нейрона в нервные импульсы происходит в аксонном холмике, но экспериментальные данные это не подтвердили. Регистрация электрических потенциалов выявила, что ПД генерируется в самом аксоне, а именно в начальном сегменте на расстоянии ~50 мкм от тела нейрона.

Рисунок 49. Принципиальная схема patch clamp в конфигурации Cell-attached.

Примечательно, в методе patch clamp используются не две пары электродов, как при двухэлектродной записи потенциала (два внутриклеточных и два внеклеточных), а лишь одна пара. При этом электронная начинка усилителя с высокой скоростью чередует измерение потенциала клетки и введение в неё ионного тока. При этом один электрод работает сразу за два, что уменьшает повреждение клеток во время измерения. Любопытной особенностью patch clamp является то, что в единственной оставшейся паре электродов невозможно однозначно идентифицировать внеклеточный и внутриклеточный потенциалы. Металлический опорный электрод погружен в ванну, в которой находятся исследуемые клетки. А вот единственный стеклянный электрод, который контактирует с клеткой, может работать как внеклеточно (cell-attache и inside-out), так и внутриклеточно (whole-cell и outside-out)1.

Микроскопические размеры электродов патч-зажима, и самих клеток вынуждают исследователей работать исключительно под микроскопом. Мало того, сам контакт микрокапилляра с мембраной клетки чрезвычайно чувствителен к вибрациям, поэтому микроскоп монтируется на антивибрационном столе, столешница которого плавает в потоке сжатого воздуха. А амплитуда токов, регистрируемых прибором, настолько мала, что электроды защищены от электрических наводок клеткой Фарадея.

Метод patch clamp открыл новую эру в электрофизиологии. А параллельное развитие молекулярной биологии привело к настоящему взрыву исследований ионных каналов в 1990-х годах.

1 Cell-attache, Inside-out, Whole-cell и Outside-out – четыре различные конфигурации схемы подключения patch-clamp

История биологических мембран

Любопытно, что одним из первых исследователей свойств липидов стал Бенджамин Франклин, который в 1773 году измерял площади масляных