Методы консервации донорских тканей в офтальмологии - Коллектив авторов

Современные исследования в области биохимии, биофизики, молекулярной биологии, генетики и др., основанные на методах кибернетики, теории информации, теории регулирования, дают возможность глубже понять диалектический характер физико-химических закономерностей в живых и трупных тканях. Реакции в донорских тканях рассматриваются в неразрывной связи с их структурой, а скорость и направление этих реакций – как комплекс обратных связей, которые обеспечивают устранение или максимальное ограничение действия факторов внешней среды. Тенденция донорских тканей к сохранению постоянства своей структуры составляет их главную особенность наравне с живыми тканями.

Оценить степень жизнеспособности донорских тканей необходимо на уровне их отдельных клеток и клеточных систем.

2. Механизмы интеграции и дезинтеграция клеточного обмена в тканях

Интеграция клеточного обмена в живых тканях осуществляется на уровне ее мембранных образований. То же самое происходит в донорских тканях, взятых от трупов в сроки от 2-х часов до 72 часов.

Электронная микроскопия позволила выявить существование не только наружной мембраны, но и большого количества внутриклеточных мембранных образований, которые разделяют клетку на относительно изолированные друг от друга пространства.

Известно, что клеточные органеллы (митохондрии, микросомы, лизосомы и т.д.) представляют собой сложные мембранные образования.

Мембраны, разделяя клетку и ее органеллы на относительно изолированные пространства, создают предпосылки для регулирования скорости ферментативных реакций, проходящих в тканях, путем перемещения веществ из одних пространств клетки в другие (Дж. Робертсон, 1964). Быстрота химических реакций в клетке обусловлена тем, что большинство из них протекает на мембранах, на высокоспециализированные ферментные системы в определенной последовательности.

Транспорт веществ через клеточные мембраны связан с изменением их механических свойств. Так, накопление К+ митохондриями сопряжено с ускорением реакций окислительного фосфорилирования и ведет к сжиманию митохондрий, выход же К+ сопряжен с набуханием митохондрий и разобщением фосфорилирования и дыхания в них. Иа поверхности мембран белковые молекулы за счет энергии АТФ катализируют процессы активного трансмембранного транспорта. Ферментативная природа процессов активного транспорта зависит от pH среды, от температуры (Johnstone, 1964). Это обстоятельство учитывается при консервации тканей.

С другой стороны, следует учитывать, что внутренний слой мембран составляют липиды. Липиды мембран связываются с ее белком электростатическими и поляризационными связями типа гидрофобных, которые участвуют в изменении конфигурации мембраны и степени ее плотности.

Таким образом, клеточный обмен в тканях осуществляется мембранными структурами на основе взаимосвязи между отдельными клеточными органеллами. Механизм передачи информации от одной органеллы к другой осуществляется как химическим (за счет изменений концентрации метаболитов, коферментов и т.д.), так и конформационным способом. В реализации последнего способа передачи информации важная роль принадлежит внутриклеточной воде, которая имеет преимущественно кристаллическое строение и обладает анизотропией физических свойств. Интегрируя обмен посредством мембран, клетка за счет кристаллических свойств внутриклеточной воды, способна поддерживать свою структуру. При разрыве внутримолекулярных связей по типу гомолиза образуются свободные радикалы и без дополнительной энергии организованных структур в тканях не происходит.

Гипоксия – причина нарушения метаболизма в тканях. Независимо от вида гипоксии, в основе характерных для нее нарушений лежат энергодефицит и активация свободнорадикальных процессов.

Расстройства гипоксического и свободнорадикального генеза по мере их нарастания ведут к деструкции клеток.

Прекращение доставки кислорода к клеткам вызывает сдвиг окислительно-восстановительного равновесия в них.

Прекращение выработки энергии аэробным путем побуждает клеточную метаболическую машину активировать анаэробный путь обмена. Единственным источником энергии в анаэробных условиях является гликолиз. По мере углубления гипоксии активность ферментов гликолиза подавляется и накапливаются недоокисленные продукты обмена в виде молочной, ацетоуксусной и других кислот.

Процессы дезинтеграции клеточного обмена начинаются с повреждения мембран. Из клеточных элементов митохондрии и микросомы наиболее чувствительны к гипоксии. Пусковым механизмом нарушения мембранных структур является действие гидролитических ферментов лизосом, активизирующихся в условиях внутриклеточного ацидоза, а также свободно радикальное окисление липидов фосфолипидных мембран.

По мере нарастания гипоксии в тканях отмечаются деструктивные изменения, выражающиеся в их отеке, набухании, в конечном итоге приводящие к гибели клеток.

Таблица 1

Пути дезинтеграции обмена при умирании клеток

В здоровых клетках всегда присутствует достаточное количество антиоксидантов-ингибиторов радикальных реакций, которые блокируют активные радикалы, тормозя развитие цепных реакций. К таким веществам относятся: серотонин, каталаза, витамин Е, витамин С, а-токоферол и др. По данным Т.Б. Сусловой с соавт. (1968) ионы Fe+2 в больших концентрациях также действуют как антиоксиданты перекисного окисления липидов.

При консервации тканей важным является сохранность их жизнеспособности. В качестве критериев гибели тканей использовалась энзиматическая активность клеток. Однако даже при наличии гистологических признаков некроза в тканях активность отдельных ферментов (лактатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа и т.д.) может сохраняться. Тканевое дыхание, гликолиз, используемые для оценки жизнеспособности тканей, также являются недостаточно информативными показателями, поскольку обломки гомогенизированных клеток могут при многих обстоятельствах дышать и продолжать накапливать молочную кислоту (Ю.М. Лопухин и др., 1969).

К настоящему времени разработаны и внедрены в практику новые методы оценки жизнеспособности консервированных тканей, в частности, роговой оболочки (С.Н. Федоров, С.А. Борзенок, З.И. Мороз, Ю.А. Комах, 1993).

Предложенный авторами скрининговый неинвазивный тест (адреналиновая проба) является наиболее чувствительным и информативным методом, контролирующим и прогнозирующим функциональную жизнеспособность роговицы как пластического материала.

3. Энергетический обмен в изолированных тканях в норме и при гипоксии

Основным источником энергии в клетке является глюкоза или гликоген, окисление которых происходит либо по пути цикла Кребса, либо по пути пептозного цикла. При повышении энергозатрат в клетке активируется цикл Кребса.

Активация пептозного цикла создает клетке покой, что обеспечивает сохранение ее структуры.

Между обоими метаболическими путями должно поддерживаться состояние динамического равновесия. На окислительно-восстановительные процессы в тканях влияет уровень катехоламинов. В анаэробных условиях процесс регуляции энергетического баланса в клетках затруднен.

Таблица 2

Последовательность нарушений энергетического обмена в тканях при гипоксии

Дефицит энергии в клетках ведет к нарушению свойств ее белков (ферментов), что вызывает накопление свободных радикалов, усугубляющих повреждение клеток.

При консервации тканей мероприятия по пролонгированию их жизнеспособности должны быть направлены на снижение расхода энергии и, прежде всего, потребности клеток в энергосубстратах и кислороде.

4. Пролонгирование энергетического обмена в изолированных тканях при гипоксии

В условиях нарастающего дефицита энергии в тканях при гипоксии с целью регулирования путей метаболизма необходимо обеспечить клеткам функциональный покой и, таким образом, замедлить скорость накопления энергетического долга.

При консервации донорских тканей, как известно, применяются различные фармакологические препараты. Оценка их влияния на жизнеспособность тканей проводится по мембранной проницаемости препаратов. Известны вещества, способные либо стабилизировать, либо лабилизировать клеточные мембраны, повышая их проницаемость. Лабилизация мембран наступает под влиянием средств, способствующих образованию свободных радикалов, таких, как цистеин, глютатион, витамин А. Все эти соединения вызывают необратимое набухание и лизис митохондрий, лизосом, микросом и других мембранных структур клетки. Аналогичное действие оказывают пирогенные стероиды, стрептолизин, изолейцин. В то же время противовоспалительные стероиды: гидрокортизон, кортизон, преднизолон, дексаметазон и др. оказывают на мембраны стабилизирующее влияние. В связи с этим, приемлемым считается обработка донорских тканей противовоспалительными гормонами перед основным процессом консервации. Защитным действием на клеточные мембраны тканей обладает метиленовый синий, бриллиантовый зеленый, некоторые хиноны (витамины Е и К), серотонин, ГОМК (гамма-оксимасляная кислота) и др. Механизм защитного действия ГОМК на ткани заключается в способности этой жирной кислоты образовывать соли с железом – катализатором образования перекисей липидов.