Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге - Коллектив авторов

Для выявления клеток злокачественных новообразований мокроту окрашивают одним из способов, применяемых для окраски мазков крови.

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Для бактериоскопического исследования мазки мокроты приготавливают, растирая тщательно выбранный кусочек между двумя предметными стеклами таким образом, чтобы мазок занял не более 2/3 поверхности стекла. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окраску мазков мокроты по Цилю—Нильсену используют для выявления кислотоустойчивых бактерий.

Метод обнаружения микобактерий туберкулеза

Микобактерии туберкулеза обнаруживают в мазке, окрашенном по Цилю—Нильсену. Окрашивают карболовым фуксином– Циля (1 г основного фуксина растирают в ступке с 10 мл 96%– ного этилового спирта; приготовленный раствор вливают в 90 мл 7%– ного раствора фенола, тщательно перемешивают; хранят в посуде из темного стекла). Кроме того, здесь необходим 3%-ный спиртовой раствор хлористо-водородной кислоты (3 мл концентрированной хлористо-водородной кислоты добавляют к 97 мл 96%-ного этилового спирта) и 1%-ный водный раствор метиленового синего. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, которая должна быть ýже предметного стекла. Наливают 2–3 мл карболового фуксина Циля. Держа препарат пинцетом, подогревают над пламенем горелки до трехкратного отхождения паров. При этом растворяется жировосковая капсула микобактерий, и они воспринимают красную краску.

Остужают, бумажку сбрасывают, препарат промывают водой и полностью обесцвечивают, погружая стекло в 3%-ный спиртовой раствор хлористо-водородной кислоты. Обесцвечиваются все части мокроты, кроме кислото– и спиртоустойчивых микобактерий.

Промывают водой и докрашивают в течение 30 с метиленовым синим. При этом все части мокроты окрашиваются в синий цвет, кроме микобактерий туберкулеза.

Вновь промывают препарат водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. На синем фоне хорошо различимы микобактерии туберкулеза красного цвета. Они полиморфны, имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины, могут быть колбовидной, пунктирной формы, располагаться поодиночке или группами.

Метод флотации Потенджера

Микобактерии туберкулеза неравномерно распределяются в мокроте, при количестве менее 100 тыс. в 1 мл обнаружить их в препарате не всегда удается. Методы накопления позволяют сконцентрировать микобактерии. Для их концентрации чаще всего пользуются методом флотации. В основе метода лежит адсорбирование микобактерий туберкулеза бензином, толуолом или ксилолом, которые всплывают на поверхности более плотной жидкости. Для этого используют 0,5%-ный раствор едкого натра (или калия); бензин (ксилол, толуол), дистиллированную воду.

Свежеприготовленную мокроту помещают в стерильную узкогорлую бутылку вместимостью 200–250 мл с хорошо пригнанной пробкой. Для флотации достаточно 10–15 мл мокроты. Ее заливают двойным объемом щелочи и энергично встряхивают в течение 10–15 мин в аппарате для встряхивания. При этом мокрота гомогенизируется, растворяются слизь и гной, освобождаются микобактерии. Затем в эту же бутылку приливают 1 мл бензина и 100 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты. Снова встряхивают в течение 10–15 мин для эмульгирования бензина. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки. Смесь оставляют при комнатной температуре на 40–50 мин. За это время капельки бензина с адсорбированными на них микобактериями всплывают, образуя в горлышке бутылки сливкообразное флотационное кольцо.

Препараты готовят на новых обезжиренных предметных стеклах, которые предварительно подогревают до 60 °С на воздушной бане. На подогретые стекла пастеровской пипеткой наносят капли из флотационного кольца, высушивают и снова наносят капли на то же место. Каждую последующую каплю наносят на высохшую предыдущую каплю. Таким образом все флотационное кольцо переносят на предметные стекла. Готовят 3–4 препарата, фиксируют и окрашивают по Цилю—Нильсену.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на том, что туберкулезные микобактерии, окрашенные ауромином, люминесцируют под влиянием ультрафиолетовых лучей в виде светящихся золотистых палочек (метод менее трудоемкий и более быстрый, чем предыдущие).

Для диагностики туберкулеза легких, кроме бактериоскопии мокроты, необходимо исследовать бронхиальные смывы, промывные воды желудка, плевральный экссудат, используя методы бактериоскопии, а также посев материала на специальные питательные среды, метод ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Окраска препаратов по Граму

В препаратах, окрашенных по Граму, обнаруживают пневмококки, клебсиеллы, стрептококки, стафилококки, друзы актиномицета и другие микроорганизмы.

Для этого используют:

1) карболовый раствор генцианового фиолетового (1 г генцианового фиолетового растирают в ступке с 10 мл 96%-ного этилового спирта; раствор вливают в 90 мл 2%-ного раствора фенола, хорошо перемешивают; хранят в бутылке из темного стекла);

2) раствор Люголя (1 г йода и 2 г йодата калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды; после растворения навески доливают 295 мл дистиллированной воды);

3) 96%-ный этиловый спирт;

4) фуксин Пфейффера (10 мл карболового фуксина Циля смешивают с 90 мл дистиллированной воды).

Мазок фиксируют над пламенем горелки. На зафиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового на 1,5–2 мин. Все части препарата окрашиваются в фиолетовый цвет. Снимают бумажку и заливают мазок раствором Люголя на 2 мин. При этом фиолетовая окраска закрепляется на грамположительной флоре. Сливают раствор Люголя. Препарат обесцвечивают 96%-ным этиловым спиртом до сероватого цвета. Грамположительная флора фиолетовую окраску сохраняет. Промывают водой и докрашивают фуксином Пфейффера в течение 10–15 с. Все части препарата, кроме грамположительной флоры, окрашиваются в красный цвет. Снова промывают водой и высушивают на воздухе.

Микроскопируют с иммерсионной системой. На красном фоне четко видны фиолетовые грамположительные микроорганизмы. Грамотрицательная флора окрашивается в красный цвет.

Пневмококки представляют собой попарно расположенные грамположительные округлые или вытянутые диплококки, окруженные капсулой. Клебсиеллы имеют вид толстых грам-отрицательных палочек различной величины с закругленными концами, расположенных попарно и окруженных капсулой. Стрептококки представляют собой круглые, мелкие, расположенные цепочками разной длины грамположительные кокки. Находятся внутри лейкоцитов и среди них. Стафилококки – круглые грамположительные кокки различной величины, располагаются единично или группами. Часто встречаются одновременно со стрептококками.

Друзы актиномицета имеют вид сплетений темно-фиолетового цвета. Каждая нить сплетения заканчивается колбовидным утолщением, окрашенным в красный цвет.

Методы ускоренной диагностики. Путем применения молекулярно-генетических методов возможно получение анализов в течение трех суток с момента поступления образца. Тест-системы основаны на амплификации генов возбудителя туберкулеза. Их применение позволяет подтвердить принадлежность возбудителя к виду M. Tuberculosis, а также наличие/отсутствие мутации у выделенного штамма, которая можен привести к устойчивости к изониазиду и рифампицину.

Изучение грибковой флоры в мокроте

Иногда в окрашенном или неокрашенном препарате можно встретить различные виды грибов.

Дрожжевые грибы рода Candida – почкующиеся клетки и короткие почкующиеся нити псевдомицелия (клетки круглой или овальной формы, псевдомицелий – членистый, ветвистый, споры на нем располагаются мутовками). Наличие этих грибов в мокроте свидетельствует об их активизации, но еще не дает основания для диагноза кандидомикоза, который ставится при учете клинических данных и повторных обнаружениях грибов.

Дрожжевой гриб Criptococcus – возбудитель бластомикоза, имеет вид круглых, частью почкующихся клеток с довольно толстыми двухконтурными стенками.

Плесневый гриб из рода Aspergillus имеет вид обрывков широких нитей