Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре - Галина Ильина

Повышенное содержание германия и активное накопление названного элемента базидиомами и мицелием грибов рода Ganoderma активно обсуждается в последние годы (Song et al., 2003). Факт повышенного, по сравнению с растительными и животными организмами (в среднем, в 50-100 раз) накопления германия грибами, а именно ксилотрофными базидиомицетами, описан в работах отечественных ученых (Воронков, Мирсков, 1982).

Микроорганизмы, как и прочие организмы, нуждаются в оптимизирующих развитие факторах, они позитивно реагируют на присутствие в питательной среде витаминов, аминокислот, цитокининов и других биологически активных веществ. Для многих базидиальных макромицетов в культуре рекомендуется внесение комплекса аминокислот и тиамина хлорида, предложена среда для базидиомицетов следующего состава (г/л): D-Glc – 10; L-Asn – 1; KH2PO4 – 5; MgSO4.7H2O – 2.5; FeSO4.7H2O – 0.03; тиамин – 5.10-4; H2O до общего объема 1 л (Song et al., 1987, цит. по Цивилева, 2008). Именно высшие базидиомицеты характеризуются выраженной гетеротрофностью в отношении тиамина, что выделяет их среди грибов других систематических групп. Потребность в этом витамине была установлена у многих видов съедобных грибов, относящихся к родам Boletus, Suillus, Paxillus, Pleurotus, Panus, Lentinus, Tricholoma, Flammulina, Collybia, Agaricus, Russula, Lepiota, Coprinus, Clitocybe, Mycena, Pholiota, Lactarius, Stropharia и др. В то же время потребность в тиамине у высших баэидиомицетов не является абсолютной. Например, выявлены штаммы видов Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus, некоторых видов рода Marasmius, автотрофные в отношении тиамина (Биосинтетическая деятельность… 1969).

А.С. Бухало с сотрудниками исследовано влияние на рост высших базидиомицетов тиамина, отваров растений, дрожжевого автолизата, других субстратов, содержащих витамины (Бухало, 1988). При этом было установлено, что на синтетической среде с тиамином больше биомассы, чем в контроле, образуют Panus conchatus, Armillariella mellea, Coprinus comatus и Macrolepiota procera, отдельные штаммы Pleurotus ostreatus и Flammulina velutipes. Стимулирующее действие на рост Fistulina hepatica, Pleurotus ostreatus, Armillariella mellea, Kuehneromyces mutabilis, Macrolepiota procera, Panus tigrinus, Flammulina velutipes и другие виды оказывают отвары крапивы и дубовой коры, дрожжевой автолизат. В качестве стимуляторов на синтетической среде с сахарозой испытаны отвары зеленой массы различных сельскохозяйственных культур. На всех средах с растительными стимуляторами, по сравнению с контролем, Fistulina hepatica, Panus conchatus, Armillariella mellea, Kuehneromyces mutabilis отдельные штаммы Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes и другие виды увеличивают продукцию биомассы. Эти культуры слабо растут на контрольной синтетической среде. Показана целесообразность использования естественных органических субстратов, содержащих витамины и другие стимуляторы, в качестве компонентов питательных сред для улучшения роста и увеличения продукции биомассы мицелия при культивировании высших съедобных базидиомицетов.

С наступлением эры антибиотиков, а позже – биологически активных добавок и в связи с широким применением микроорганизмов в разных отраслях промышленности остро встал вопрос об экономически оправданных, сбалансированных по составу питательных средах. Эффективной добавкой оказался, благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах, кукурузный экстракт (Мосин, 2002). Кроме кукурузного экстракта в рецептуры сред включают дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, гидролизат дрожжей, клеточный сок картофельных клубней, молочную сыворотку, экстракт пшеничных отрубей, экстракт солодовых ростков и другие продукты. В целях снижения затрат на ингредиенты для питательных сред в настоящее время широко используются отходы сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности (Обрезкова и др, 2010). Например, предложено в качестве источника углерода, азота, фосфора, микроэлементов, а также индуктора ферментов использовать прогидролизованный ячменный солод; в качестве стимуляторов роста и биосинтеза ферментов – прогидролизованные солодовые ростки; в качестве индуктора пектолитических ферментов – прогидролизованный свекловичный жом (Салманова, Соболевская, 1994).

В последние десятилетия как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства предлагается также глубинное культивирование (Yang, Jong, 1989). Очень небольшое число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. Необходимым условием роста и развития мицелия базидиальнх макромицетов в глубинных условиях является достаточное количество кислорода. Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от источника окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давлении 0,1 МПа (1 кгс/см2) и температуре 30 °C в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2 – 5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5 – 2 мин (Мосин, 2002). При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость адсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды. Установлено, что во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита.

Реакция погруженных культур ряда видов ксилотрофных базидиомицетов на изменение содержания кислорода в среде описана нами (Ильина, 2008).

Значительная часть сред, рекомендованных для выделения культур грибов, содержит селективные компоненты. Для подавления роста бактерий нередко добавляют противобактериальные антибиотики или снижают рН среды. С целью подавления роста грибов, сопутствующих выделяемому виду, кроме противогрибных антибиотиков используют и другие фунгицидные препараты – бычью желчь, кристалл-виолет, пропионат кальция и др. Широко используемой средой для выделения и культивирования как сапрофитных, так и прочих грибов, является декстрозный агар Сабуро, содержащий (г/л): глюкозу 40,0 г; пептон 10,0 г; агарагар 20,0 г при рН 5,6±0,2. Благодаря низкому значению рН, рост бактерий на этой среде подавляется. Однако наибольшее распространение нашли среды, представляющие собой модификации оригинальной среды Сабуро, придающие ей дифференциальнодиагностические свойства. Известной модификацией, используемой в свою очередь в составе других сред, является модификация Эммонса, отличающаяся от оригинальной среды тем, что содержит только 2 % глюкозы, вместо 4 %, и рН на уровне нейтрального – 6,9–7,0. Добавлением к среде такого состава антимикробных препаратов в различных комбинациях, включающих циклогексимид, хлорамфеникол, гентамицин, ципрофлоксацин, пенициллин или стрептомицин для ингибирования роста некоторых грибов и бактерий, достигается ее селективность. Aгар Сабуро в модификации Эммонса с добавлением хлорамфеникола (50 мг/л) и циклогексимида (500 мг/л) является селективным и используется для выделения патогенных грибов из биообразцов, высококонтаминированных сапрофитными грибами и бактериями. Эта среда встречается под коммерческими названиями Mycobiotic agar (Difco), Mycosel agar (BBL).

Признанной микологами – практиками особенностью большинства видов ксилотрофных базидиомицетов является такая их характеристика, как хороший рост в культуре. По сравнению со многими другими представителями грибов, эта группа представлена, в большинстве своем, факультативно-сапротрофными видами, чьи трофические потребности относительно легко удовлетворяются в условиях лабораторного культивирования. Однако, проблемы оптимизации выделения, хранения, поддержания стабильности штаммов остаются весьма актуальными. Разработка новых, адаптированных с учетом узкой трофической специализации, происхождения, возраста сохраняемой культуры, приемов представляется перспективным направлением исследований.

1.3 Ксилотрофные базидиомицеты как перспективный объект биотехнологии

Искусственное выращивание грибов способно внести существенный вклад в дело обеспечения продовольствием возрастающего населения земного шара. Грибы употребляют в пищу с глубокой древности, поэтому сделать грибы такой же управляемой сельскохозяйственной культурой, как зерновые злаки, овощи, фрукты, давно уже стало актуальной задачей. Наиболее легко поддаются искусственному выращиванию дереворазрушающие грибы. Это связано с особенностями их биологии, их способность легко расти и плодоносить использовали с древнейших времен.