Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре - Галина Ильина

В качестве питательных субстратов для получения плодовых тел в лабораторных исследованиях используют пористые материалы, например, смоченные разбавленным пивным суслом или минеральной средой древесные опилки и древесную муку, мелко нарезанные веточки и хвою, высушенный ржаной хлеб с водой, кашицу из хлебных крошек, размягченную в 40 %-ном растворе лимонной кислоты. Многие исследователи занимались разработкой питательных сред для получения плодоношений отдельных видов высших базидиомицетов: Flammulina velutipes Lentinus edodes, Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus и др. (Plunkett, 1953; Leatham, 1983). Однако трудно судить, оптимальны ли предложенные среды, так как отсутствуют качественные и количественные данные о продуктивности плодоношения грибов на этих средах.

Плодоношение можно получить как на твердых, так и на жидких средах в поверхностной культуре, но на жидкой среде плодовые тела обычно появляются позднее (Бухало, 1988).

Состав питательной среды является одним из определяющих факторов, влияющих на плодоношение высших базидиомицетов в условиях чистой культуры (Бухало, 1988). Изучение влияния компонентов питательной среды на плодоношение, проведенное на синтетических средах рядом исследователей, позволило сделать определенные выводы, суммированные Ф. Орриер (Horriere, 1979). Для получения плодоношения в чистой культуре питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Источник углерода в наиболее часто используемых для плодоношения средах вносится в виде углеводов (глюкозы, мальтозы, сахарозы, спирта). У некоторых видов, особенно древоразрушающих грибов, добавление в питательную среду фильтровальной бумаги или соломы стимулирует плодоношение. Азот в такие среды вносится в органической (в виде аланина, аспарагина, других аминокислот) или минеральной форме. В последнем случае предпочтение отдается аммонийным солям.

Большое значение для развития организмов и образования ими метаболитов имеет количественное соотношение источников углерода и азота, содержащихся в среде. Известно, что для наиболее благоприятного роста мицелия в среде должно существовать определенное соотношение между углеродом и азотом, что составляет примерно 20:1 (С: N = 20) (Беккер, 1988). Однако такое соотношение углерода и азота не всегда благоприятно для образования метаболитов. Например, далеко не во всех случаях биосинтез антибиотика происходит пропорционально накоплению биомассы микроба-продуцента (Мосин, 2002). Зачастую при хорошем росте организма не наблюдается образования антибиотика или он синтезируется в небольшом количестве. Поэтому при культивировании штамма с целью образования им веществметаболитов необходимо в каждом конкретном случае подбирать соответствующие соотношения углерода и азота в среде. В питательной среде, предназначенной для получения стадии телеоморфы у базидиальных грибов также большое значение имеет отношение С: N. При его очень высоких показателях плодоношение обычно отсутствует, а при очень низких – образуется много зачатков, но плодовые тела не развиваются (Plunkett, 1953; Sugimori et al., 1971; Horriere, 1979; Бухало, 1988). Оптимальное значение отношения С: N в этом случае приближается к 30, оно зависит от состава среды (Horriere, 1979), некоторое увеличение в которой азота и уменьшение углерода ускоряют появление плодоношения.

По сведениям З.Э. Беккер, приблизительно 17 – 18 минеральных элементов необходимы для основного обмена грибов. В их число входят макро- и микроэлементы, такие как сера, фосфор, калий, железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций. В этих же работах указывается возможность потребности в кобальте, галлии, боре, скандии, ванадии (Беккер, 1963; Беккер, 1988).

Достоверно выявлено, что изменение компонентов питательной среды сказывается на накоплении минеральных веществ в мицелии. Так, количество золы в мицелии трутовика Fomes marginatus оказалось очень большим при выращивании его на неразбавленной среде Варена (Рипачек, 1967). Количество минеральной золы, встречающееся у грибов, колеблется в пределах от 6 до 12 % от массы сухого мицелия. В их зольном составе обычно преобладают фосфор и калий, меньше магния и железа. Так как потребность в минеральных компонентах питательной cреды складывается на основе преобладающих у данного вида путей метаболизма, состав основных компонентов золы может варьировать. Так, у дрожжей с преобладанием гликолитического пути обмена, связанного с переработкой углеводов через путь спиртового брожения, при слабом размножении клеток в составе золы обнаружено до 50 % фосфора, который особенно необходим для этих процессов, и 25 % калия. Однако у малоспособных к спиртовому брожению, но сильно разрастающихся гифообразных грибов наблюдается в золе обратное соотношение (Беккер, 1988). В остальных 25 % от состава золы грибов в обоих случаях можно обнаружить до 50 различных элементов, обычно встречающихся в почве: марганец, железо, магний, цинк, медь, кальций (Добровольский, 2004). Фосфор, калий и сера составляют контингент самых важных неорганических компонентов обмена.

Данные о роли многих микроэлементов в процессах роста и метаболизма культур микроорганизмов представлены, в большинстве своем, общими сведениями. Обзор роли железа, магния, кальция, калия, а также целого ряда прочих микроэлементов свидетельствует, что исследования в этой области, касались, в основном, продуцентов антибиотиков. Микроэлементы Cu, Zn, Mn, Мо, Со также играют существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов, причем роль этих элементов в клеточном метаболизме ксилотрофных базидиомицетов велика и в достаточной степени изучена.

Названные элементы обладают высокой каталитической активностью в процессах внутриклеточного обмена. Их каталитическая активность возрастает в тысячи и миллионы раз в тех случаях, когда ионы металлов соединятся с молекулами органических веществ и образуют так называемые органоминеральные комплексы. Эти внутрикомплексные металлорганические соединения (хелаты) играют важную роль в реакциях фермент – субстрат.

Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем. Представителями этой группы ферментов являются полифенолоксидазы и аскарбиноксидазы, нитратредуктаза, альдегидоксидаза и др. Особую значимость медь имеет для ксилотрофных безидиомицетов – грибов белой гнили, поскольку ионы меди входят в состав активных центров «голубых» оксидаз. В активный центр лакказ входят четыре иона меди, координированное взаимодействие которых приводит к сопряжению процесса одноэлектронного окисления субстратов – доноров с четырехэлектронной реакцией восстановления дикислорода (Горбачева и др., 2008). Установлено, что глубинная биомасса высших базидиальных грибов обладает значительным потенциалом для связывания ионов меди (Ровбель и др., 2004). Изучено влияние различных концентраций меди на накопление биомассы и синтез липидов у Pleurotus ostreatus. Добавление в среду ионов меди в низких концентрациях (1 мМ) способствовало, на фоне некоторого угнетения роста, интенсивному накоплению общих липидов, тогда как повышенное содержание элемента (5 мМ) приводило к резкому снижению обоих показателей (Николайчук и др., 2005). Различное действие низкой и высокой концентраций ионов меди на накопление общих липидов в мицелии может быть обусловлено разной степенью ингибирования (или активирования) ионами меди ферментов, участвующих в синтезе липидов, а также изменением структуры мембран клеток (Демидчик и др., 2001).

Марганец входит в состав многих ферментных систем ксилотрофных базидиомицетов и, в первую очередь, в состав карбоксилаз. Он принимает, по-видимому, участие в синтезе протеиназ. Марганец входит также в состав фосфорилаз, которые участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Фермент Mn-зависимая пероксидаза был выделен наряду с лигниназой из культуральной жидкости гриба Phanerochaete chrisosporium (Kuwahara et al., 1984). Установлено, что фермент содержит гем и окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Однако из пероксидаз этот фермент отличается тем, что для проявления его активности необходимо присутствие в среде марганца (Harvey et al., 2001). Данный фермент способен регенерировать пероксид водорода, используя в качестве доноров протонов восстановленные глутатион и NADH (Asada et al., 1995). Обнаружено позитивное влияние ионов марганца на темпы формирования такой маркерной морфологической структуры как коричневая пленка у Lentinus edodes (Цивилева и др., 2006).

В целом, обзор данных о роли микроэлементов в процессах роста и метаболизма базидиомицетов, свидетельствует о том, что конкретная информация однобока и несколько ограничена. Указывается, что недостатком в среде минеральных элементов, в частности фосфатных и сульфатных ионов, К, Mg, ряда других микроэлементов (железа, цинка, марганца, меди, бора и молибдена) часто ингибируется плодоношение макромицетов в культуре. (Бухало, 1988). Определенный интерес, на наш взгляд, представляет исследование роли, в частности, в развитии культур древоразрушающих базидиомицетов, ряда эссенциальных элементов, таких как селен, германий. Факт повышенного содержания селена в плодовых телах базидиомицетов установлен и описан в литературе (Ермаков, Ковальский, 1979; Блинохватов, 1995). Наши исследования, проведенные в 19962002 гг. обнаружили интересные зависимости в реакциях на внесение соединений селена в питательные среды у быстро и медленнорастущих культур базидиомицетов (Денисова (Ильина), 1999; Блинохватов и др., 2000; Иванов и др., 2000; Ильина, Сашенкова, 2002).