Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии - Коллектив авторов

Жидкость Карнуа. Эта фиксирующая жидкость хорошо сохраняет структуру ядра клетки и часто применяется при необходимости быстрой фиксации и ускоренной проводки. Фиксатор готовится менее чем за 1 ч до начала фиксации. Фиксатор состоит из абсолютного спирта (можно заменить и 96 %-м), хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношениях 6: 3: 1. При фиксации в жидкости Карнуа следует вырезать кусочки толщиной не более 4 мм. Продолжительность фиксации составляет 3 – 4 ч. Длительное пребывание объектов в фиксаторе в большинстве случаев нежелательно. После жидкости Карнуа материал обезвоживают в абсолютном этаноле, после чего можно сразу приступать к заливке. В случае необходимости после фиксации и обезвоживания материал можно длительно хранить в метилсалицилате (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Спирт-цинковый фиксатор по Рейману и Унна (1912) состоит из 2 % раствора хлористого цинка в 96 %-м этаноле. Этот фиксатор Б. Ромейс рекомендует для лучшего выявления цитоплазмы клеток.

Этанол-уксусная кислота. Смесь 96 %-го этанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3: 1 в англоязычной литературе иногда называют жидкостью Карнуа I, а обычную жидкость Карнуа – Карнуа II. Условия фиксации материала аналогичны условиям фиксации в жидкости Карнуа.

Спирт-формалин-уксусная кислота (СФУ). Существует несколько вариантов фиксирующих растворов, в которые входят помимо этанола формалин и ледяная уксусная кислота. Все они считаются (Лилли Р., 1969) хорошими фиксаторами для цитоплазматических структур и являются оптимальными для стабилизации гликогена в тканях. Фиксирующие растворы готовятся в день взятия материала, поскольку их качество изменяется с течением времени. СФУ по Лилли состоит из 85 мл 96 %-го этанола, 10 мл концентрированного (35 – 40 %) формальдегида и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Для лучшей стабилизации гликогена рекомендуется фиксировать материал при 0 – 5 °C в течение 24 ч. После фиксациидальнейшую проводку можно начинать с 96 %-го этанола. СФУ по Теллесницкому готовится из 100 мл 70 %-го этилового спирта, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл концентрированного формальдегида. Продолжительность фиксации объектов – 18 – 24 ч. После фиксации проводку следует начинать с 80 %-го этанола. В нем объекты могут быть оставлены и для длительного хранения, поскольку тинкториальные свойства не изменяются.

1.2.4. Метанол

Метанол является высокотоксичным соединением и поэтому редко используется в гистологической практике. Однако абсолютный метанол является лучшим фиксатором для мазков крови и красного костного мозга. Традиционно его рекомендуют и для фиксации других цитологических объектов. Фиксацию мазков в метаноле осуществляют следующим образом: в герметично закрытый стакан с абсолютным метанолом помещают предметные стекла с мазками на 5 – 10 мин, затем их извлекают и просушивают (Артишевский А. А. [и др.], 1999).

Метанол-уксусная кислота. В последнее время большое распространение получил фиксатор, состоящий из метанола и уксусной кислоты в соотношении 3: 1 (мета-Карнуа). Он рекомендован для фиксации объектов, в которых планируется выявлять аргентофильные белки ядрышкового организатора (Ag-NOR). Сроки фиксации аналогичны срокам, рекомендованным для жидкости Карнуа (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Р. Лилли (1969) приводит сведения о фиксаторе метанолхлороформ (2: 1; время фиксации – 12 – 48 ч), который рекомендуется для экстракции липидов из нервной ткани при комбинированной заливке в целлоидин-парафин. При использовании метанол-хлороформа возможно получение срезов толщиной 2 мкм.

1.2.5. Изопропанол

Изопропанол не применяется в гистологии в качестве самостоятельного фиксирующего вещества в связи с плохим проникновением в ткани. Однако он может быть использован в комбинации с другими веществами в составе сложных фиксаторов. В качестве примера можно привести жидкость Ньюкомера и цинк-ацетонизопропанол-формальдегид (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006).

Жидкость Ньюкомера дает примерно такие же результаты фиксации, как и жидкость Карнуа. Этот фиксатор состоит из 60 мл изопропанола, 30 мл пропионовой кислоты, 10 мл ацетона и 10 мл диоксана. Образцы тканей следует фиксировать 12 – 24 ч при комнатной температуре и затем хранить при 3 °C в свежей порции фиксатора. Для промывки после фиксации и обезвоживания следует использовать изопропанол (Лилли Р., 1969).

1.2.6. Уксусная кислота

Уксусная кислота сама по себе употребляется для фиксации очень редко, так как в чистом виде она дает плохие результаты. Очень часто ее прибавляют к другим фиксирующим жидкостям. Ледяной уксусной кислотой называют 100 %-ю уксусную кислоту, концентрированная уксусная кислота содержит 4 % воды. Фиксирующее действие уксусной кислоты распространяется в основном на структуры клеточного ядра и хромосомы.

Уксусная кислота – орсеин. 1 г орсеина растворяют в 45 мл горячей уксусной кислоты, охлаждают и добавляют 55 мл дистиллированной воды. Полученный реактив обладает одновременно фиксирующими и окрашивающими свойствами. Он хорошо окрашивает гетерохроматин и хромосомы в цитологических препаратах (Лилли Р., 1969).

1.2.7. Формалин

Формалин – наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость. Формалин хорошо проникает в ткани и потому применяется для фиксации довольно крупных объектов. Формалин придает ткани плотность, вполне подходящую для резки на замораживающем микротоме и вибратоме. Существенное преимущество формалина состоит в том, что препараты можно хранить в нем годами, у них сохраняется способность к окрашиванию наиболее часто используемыми методами (гематоксилинэозином, по Ван-Гизону). Особенно ценной является способность формалина хорошо сохранять липиды, что важно для фиксации нервной ткани. Фиксация чистым формалином менее пригодна для различных цитологических исследований, например для ядерных структур, для органов кроветворения, для обнаружения гликогена или железа. Недостатками формалина являются:

– ухудшение окраски тканей при продолжительной фиксации и хранении «влажного архива»;

– возможность выпадения формалиновых осадков;

– сильное маскирующее действие на большинство антигенов, выявляемых иммуноцитохимически.

Для приготовления формалинового фиксатора используют готовый 35 – 40 % водный раствор формальдегида (альдегида муравьиной кислоты). Следует учитывать, что концентрированный раствор формальдегида обычно содержит метиловый спирт (около 10 %), который добавляют для стабилизации раствора и предотвращения полимеризации формальдегида. Формалин следует хранить в защищающих от света коричневых склянках при температуре не ниже 9 °C. При более сильном охлаждении в растворе появляется муть, которая постепенно оседает в виде белого осадка (параформальдегид и триоксиметилен). При длительном хранении раствор формальдегида медленно окисляется, происходит накопление муравьиной кислоты.

В большинстве случаев препараты удовлетворительного качества можно получить при использовании в качестве фиксирующей жидкости обычного (кислого, не нейтрализованного) 10 %-го формалина. Его готовят из концентрированного раствора формальдегида, добавляя к одной его части 9 частей водопроводной воды. Не следует использовать формальдегид с белым осадком. Часто рекомендуемый способ растворения осадка путем нагревания в вытяжном шкафу на практике мало применим. При появлении незначительного осадка в емкости с концентрированным раствором формальдегида следует уменьшить его разведение (1: 6 вместо 1: 9). При наличии значительного осадка раствор формальдегида становится непригодным для использования (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Определение концентрации формалина в растворе представляется затруднительной задачей. Существующий метод титрования описан у Б. Ромейса (1954), однако он чрезвычайно сложен и поэтому не может быть рекомендован для практических целей. Упростить решение этой задачи позволяет специальная индикаторная бумага, выпускаемая фирмой Sakura (Япония).

При необходимости использования нейтрального раствора формалина (для фиксации нервной ткани, при применении специальных окрасок, при проведении иммуноцитохимического исследования) его готовят следующим образом: раствор формальдегида (37 – 40 %) – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл, однозамещенный фосфат натрия – 4 г, безводный двузамещенный фосфат натрия – 6,5 г. Этот раствор стабилен при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Использование нейтрального формалина позволяет существенно уменьшить вероятность отложения формалиновых осадков, появление которых обусловлено взаимодействием гемоглобина с кислыми растворами формалина (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Нейтрализация формалина по Б. Ромейсу. Формалин оставляют надолго в коричневой склянке над слоем порошкообразного углекислого кальция толщиной 1 – 2 см. Вначале склянку несколько раз энергично взбалтывают. Обычно кислота достаточно нейтрализуется уже через 24 ч.