Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии - Коллектив авторов

Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БСА – бычий сывороточный альбимин

ГОФП – гематоксилин-основной фуксин-пикриновая кислота

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК – рибонуклеиновая кислота

ОКГ – оранжевый, красный, голубой

СФУ – спирт-формалин-уксусная кислота

ШИК – шифф-йодная кислота

EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота

DDSA – додециловый ангидрид янтарной кислоты

DMP-30 – 3-диметиламинометилфенол

MNA – метиловый эфир надовой кислоты

PI – пропидия иодид

ПРЕДИСЛОВИЕ

Среди современных методов лабораторной и клинической диагностики морфологические методы по праву занимают одно из первых мест благодаря своей информативности и диагностическому значению. К ним относятся методы, применяемые при гистологической и цитологической диагностике в онкологии, гематологии, неврологии, патологической анатомии и судебной медицине, а также многочисленные методы лучевой диагностики, которые не рассматриваются в настоящей книге. В отдельных случаях точный диагноз не может быть установлен без использования ультраструктурного исследования (электронной микроскопии). Иногда может оказаться полезным и применение специальных методов микроскопии – поляризационной, флуоресцентной и конфокальной лазерной. Все эти морфологические методы используются и при проведении научных исследований для разработки адекватных биологических моделей заболеваний человека и создания новых лекарственных препаратов и технологий, предназначенных для лечения моделируемых заболеваний.

В связи с высокой информативностью и исключительной иллюстративностью морфологические методы исследования достаточно широко используются не только специалистами – гистологами и патологоанатомами, профессиональная подготовка которых предусматривает детальное изучение гистотехнологии и основ ультраструктурного исследования, но и врачами, а также научными работниками других специализаций. В этих случаях как у клиницистов, так и у научных работников иногда возникает необоснованное впечатление о простоте использования гистологических методов и легкости получения необходимой информации с их помощью. Тем не менее некоторые гистологические методы достаточно сложны даже для опытного специалиста-морфолога (современные методы электронной микроскопии, иммуноцитохимии, конфокальной лазерной микроскопии). Поэтому одной из главных задач настоящего руководства является ознакомление специалистов различных профилей с ключевым разделом гистологического и электронно-микроскопического исследования – пробоподготовкой. Без адекватной пробоподготовки невозможно получить содержательные результаты высокого качества, пригодные для диагностики и научных целей. Именно на этом этапе исследования делают большинство ошибок начинающие специалисты и формируется подавляющее большинство артефактов, способных ввести в заблуждение даже опытных аналитиков.

В представленном руководстве обобщен опыт ведущих отечественных и зарубежных специалистов в области гистологической техники и гистотехнологии. Многие из представленных протоколов в настоящее время используются при проведении исследований, выполняемых в лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы в Институте экспериментальной медицины (ИЭМ). Часть из приведенных в настоящем издании сведений отражает многолетний опыт ведущей отечественной гистологической школы, созданной Николаем Григорьевичем Хлопиным и Владимиром Павловичем Михайловым, который бережно сохраняли и передали своим коллегам сотрудники лаборатории экспериментальной гистологии ИЭМ. Данные, касающиеся подготовки материала для электронной микроскопии, представлены с учетом многообразного собственного опыта авторов соответствующего раздела и методических разработок сотрудников лаборатории цитологии ИЭМ, организованной профессором А. А. Маниной.

Авторы считают своим долгом поблагодарить всех, кто способствовал выходу в свет этой книги. Особо следует отметить неоценимую помощь лаборанта-исследователя Ларисы Николаевны Шатило при отработке и проверке методов заливки гистологического материала. В работе над отдельными текстами, вошедшими в настоящую книгу, принимал участие к. м. н. А. В. Гиляров. Протокол окраски головного мозга по методу Клювера – Баррера выверен сотрудницей физиологического отдела им. И. П. Павлова ИЭМ М. А. Шкляевой. В разработке метода одновременного селективного выявления эозинофильных гранулоцитов и тучных клеток дыхательных путей принимал участие аспирант Санкт-Петербургской химикофармацевтической академии П. А. Ворончихин. Рисунки выполнены И. С. Кирик.

Редактор руководства приносит сердечную благодарность своим учителям – доценту Людмиле Ростиславовне Сапожниковой, профессору Георгию Сильвестровичу Катинасу и члену-корреспонденту РАМН Владимиру Александровичу Отеллину.

Авторы надеются, что представленные в книге прописи и протоколы, а также сведения о производителях высококачественных реагентов, материалов и приборов для микроскопии и диагностики помогут всем, кто планирует использовать в своей повседневной работе и научных исследованиях современные методы гистологии, цитологии и электронной микроскопии.

Раздел I

ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1

ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Общие положения

Фиксация – один из ключевых этапов гистологического исследования, от которого во многом зависит качество получаемого препарата. Фиксированный не по правилам или недофиксированный препарат, как правило, непригоден для микроскопического анализа, поэтому необходимо тщательно соблюдать правила фиксации и регулярно контролировать качество реагентов, используемых для приготовления фиксирующих растворов.

Фиксация обеспечивает стабилизацию и уплотнение тканевых структур. Выбор фиксирующей среды зависит от задач исследования. Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее чем в 10 раз. Кусочки в растворе не должны слипаться и скапливаться на дне банки. В большинстве случаев (если нет особых указаний) фиксацию следует проводить при комнатной температуре, поскольку охлаждение раствора ведет к замедлению процесса фиксации, а подогрев – к быстрому развитию аутолиза в центральной части фиксируемого объекта (той области, в которую не успел проникнуть фиксатор).

Важным моментом является правильное иссечение объектов, предназначенных для фиксации и дальнейшего гистологического исследования. Кусочки органов следует вырезать острым ножом или бритвой. Не рекомендуется пользоваться ножницами во избежание травмирования объектов. Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность, особенно слизистую и серозную оболочки.

Для микроскопического исследования вырезают кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см. Длина и ширина могут быть различными (обычно 1,0 × 1,5 см). При этом стараются сформировать объект с таким расчетом, чтобы получаемый срез поместился на стандартное предметное стекло. Ввиду медленного проникновения фиксатора в глубину ткани не рекомендуется брать для исследования более толстые кусочки. Кусочки сразу же помещают в фиксирующую жидкость. Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией (это может привести к удалению объектов, имеющих диагностическое значение, и появлению артефактов).

1.2. Фиксация материала для световой микроскопии

Световая микроскопия – микроскопия в проходящем свете видимого спектрального диапазона с использованием способности различных компонентов гистологического препарата к селективному восприятию биологических красителей. Для того чтобы структуры, наблюдаемые в микроскоп, хорошо сохранялись при обработке иссеченного материала, необходимо сделать их устойчивыми к действию применяемых при проводке и окраске химических реагентов. Подобная устойчивость структур, а также уплотнение материала достигаются в ходе фиксации. Фиксация необходима и для максимального сохранения внутриклеточных и тканевых взаимоотношений, только при этом условии можно получить информативные препараты для диагностических и исследовательских целей.

Существуют физические и химические способы фиксации. К первым относятся действие высокой температуры и влияние электромагнитного излучения в сверхвысокочастотном диапазоне (микроволновая фиксация). В настоящее время высокотемпературная фиксация применяется редко. По С. С. Вайлю, кусочки нефиксированной ткани помещают в кипящую воду на 1 – 3 мин, после чего переносят в 90 – 100 %-й этанол и после обезвоживания заливают в парафин. Р. Лилли (1969) рекомендует использовать для варки изотонический раствор хлорида натрия (0,85 – 0,90 %) и изготавливать срезы на замораживающем микротоме без заливки. В этом случае препарат можно получить через несколько минут после доставки срочной биопсии. К возникающим артефактам относят сильное сморщивание тканей и разрушение нежных структурных образований (Вайль С. С., 1934).