Интернет-журнал 'Домашняя лаборатория', 2008 №3 - Журнал «Домашняя лаборатория»
Шрифт:
Интервал:
Закладка:
Добавка ПАВ ведет, прежде всего, к увеличению эффективности разделения белков. При этом взаимодействия между молекулами различных ПАВ и пробами могут быть очень различными. С одной стороны, можно конечно обсуждать, вопрос адсорбции детергентов на биомолекулах. Следствием этого является улучшение растворимости и увеличение гидрофильного характера пробы. Наряду с этим, большую роль играет также адсорбция ПАВ на стенках капилляров. Это приводит как к увеличению гидрофильности поверхности, так, и к возможной блокировке адсорбционных центров.
При использовании катионных детергентов, например, ЦТАБ, формируется двойной электрический слой, в котором положительные заряды направлены внутрь капилляра. Тем самым достигается обращение ЭОП. Вследствие того, что поверхность заряжена положительно, адсорбция катионных белков тормозится электростатическим отталкиванием от стенки. При этом в случае основных белков достигается большое число ступеней разделения и симметричность пиков. Вообще следует обращать внимание на то, чтобы добавленным детергентом не превысить критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).
Неионные ПАВ, например BRIJ 35, также могут быть использованы для уменьшения взаимодействия белок-стенка. Для еще большего увеличения адсорбции этих детерегенов на поверхности капилляра и полного подавления ионных взаимодействий с силанольными группами, стенка обрабатывается дополнительно условно "толстым" покрытием С 18.
Принципиально должна существовать также возможность использования в КЗЭ испытанного в классическом электрофорезе и в жидкостной хроматографии анионного ПАВ ДДСН. Однако в систематических исследованиях кислых белков оказывается, что добавка ДДСН в количествах от ррт до одного процента к пробе и к буферу приводит к очень неопределенным результатам. В общем случае не улучшается ни эффективность, ни селективность, а даже наблюдается некоторое ухудшение этих характеристик. Возможным объяснением этого может быть хорошо известное действие денатурации, оказываемое ДДСН на белок. Наряду с этим, в наблюдаемой потере селективности большую роль играет, конечно, адсорбция ПАВ на биомолекулах и связанное с этим появление заряда пробы. Первоначальная структура заряда белков может полностью исчезнуть или перекрываться этим эффектом, так что разделение в электрическом поле произойдет только лишь по адсорбированным зарядам детергентов.
Рис. 59. Катионные ПАВ.
Этот эффект был использован в ДДСН-ПААГ-электрофорезе для определения ММ белков. Этот же способ может быть реализован в капилляре и позже будет описан в главе "Капиллярный гелевый электрофорез".
Резюмируя, можно отметить, что в случае добавок детергентов для разделения белков в КЭ многообещающим представляется использование в качестве динамических покрытий в основном неионных ПАВ, т. к. они лишь незначительно изменяют структуру заряда пробы. Конечно, этот метод включает совместное действие химического модифицирования поверхности и динамического покрытия, в результате чего преимущества доступности и простоты применения буферных добавок в конце концов теряются.
Неблагоприятную адсорбцию белков на поверхности капилляра можно уменьшить также добавками низших полиаминов, например, 1,3-ДАП. При этом получают высокую эффективность, однако из-за большой собственной электропроводности буфера следует использовать электрические поля низкой напряженности. Действие буферных добавок, вероятно, частично объясняется необратимой адсорбцией на стенках капилляра. Поэтому одновременно со снижением адсорбции пробы происходит резкое уменьшение электроосмоса. В качестве примера на рис. 60 показано разделение стандартных белков.
9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью
ЭОП можно регулировать также с помощью химического модифицирования поверхности капилляра. Одновременно с этим могут уменьшаться возможная адсорбция компонентов пробы на поверхности капилляра и улучшаться воспроизводимость анализов. Для химического покрытия капилляров можно использовать различные способы. Химически модифицированные капилляры коммерчески доступны.
Рис. 60. Разделение стандартных белков в буферной системе ДАП.
Условия: капилляр 75 мкм, 37/44 см, поле: 272 В/см; детектирование: 214 нм, фосфатный буфер со 100 мМ ДАП, pH 3.0; проба: цитохром С, лизоцим, рибонуклеаза А.
9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ
Принципиально различаются два метода нанесения слоев на поверхность. Сначала использовали метод традиционной химии силанов, при котором моно-, ди-, или трисиланы присоединяются к силанольным группам на стенках капилляров с образованием силоксановых связей. Функциональные группы, введенные сначала поверх силанов, можно использовать еще и на второй стадии для окончательного модифицирования поверхности.
Перечень описанных к настоящему времени в литературе т. н. общепринятых типов покрытий, приведен в таблице 23. Основным ограничением метода является недостаточная стабильность силоксановых связей по отношению к гидролизу в щелочных условиях. Этот метод достаточно хорошо известен в жидкостной хроматографии.
Недостаток этого метода можно обойти, применяя способы покрытия стенок капилляра полимерами, которые представляют собой вторую большую группу используемых покрытий. Здесь опять различают два способа:
— поверхность предварительно обрабатывается классическим способом химии силанов и при этом на нее наносятся т. н. якорные группы, на второй стадии они могут сополимеризоваться с соответствующими мономерами или олигомерами;
— на соответствующий носитель адсорбируется первичный полимер, который затем сополимеризуется in situ и поперечно связывается в сетку.
Поверхности с нанесенными слоями полимеров проявляют более высокую рН-стабильность в щелочах при pH около 9.
Недостаток покрытия полимерами заключается в сильной гидрофобности (адсорбция белков!), так что такого рода фазы часто используются в присутствии неионных или внутреннеионных детергентов. Сопоставление применяемых до настоящего времени полимерных покрытий приведено в таблице 24.
9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров
9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров
На основании многолетнего опыта изготовления кварцевых капилляров с покрытием для ГХ известно, что перед собственно химическим модифицированием очень полезно провести предварительную обработку материала. Капилляры, применяемые в КЭ, обычно изготавливаются либо из "некондиционных" трубок, применяемых в ГХ, либо из отходов производства световодов. Поэтому качество материалов различных трубок относительно их шероховатости и загрязнения адсорбированными ионами металлов очень различается.
Большинство описанных в литературе методов заключаются в обработке капилляров щелочами или кислотами для улучшения смачиваемости поверхности. Кроме этого, поверхность также химически истощается, и образуются новые силанольные группы. Это выгодно, поскольку дополнительно образуемые SiOH-группы играют роль центров связи с покрытием и тем самым помогают улучшению химического обмена со стенкой капилляра. Эта стадия заканчивается обычно нейтральной промывкой в дистиллированной воде и сушкой в потоке газа при повышенных температурах (80-200 °C).
Не все авторы указывают на необходимость предварительной обработки для успешного покрытия капилляров.
9.2.2.2. Методы покрытия
В ГХ известны два основных метода модифицирования поверхности капилляров. Первый метод — это т. н. "метод динамического покрытия". В этом случае порция жидкости, состоящая из раствора стационарной фазы, пропускается через
