Интернет-журнал 'Домашняя лаборатория', 2008 №3 - Журнал «Домашняя лаборатория»

19 приведены другие буферные системы, применяемые для разделения катионов с непрямым детектированием. По подвижностям ионов пробы можно выбрать подходящий разделяющий буфер. Значения pKs берутся из литературы или определяются титрованием.

Соответствующие УФ-спектры важнейших буферных компонентов представлены на рис. 51.

Рис. 51. УФ-спектры буферных веществ, которые можно применять для непрямого детектирования катионов. УФ-спектры веществ, протонированные уксусной кислотой, получены на детекторе Perkia Elmer LC 480 Diodea Array.

Воспроизводимость разделения в ионной аналитике при применении буферных систем очень хорошая. ОСО времен миграции лежат ниже 0.5 %, воспроизводимость площади пика — важнейшая величина для количественных анализов — лучше 2.3 %. Наряду с точностью для количественных расчетов важной величиной является их достоверность, которая подтверждается данными других методов. В качестве альтернативных методов измерения выступают атомно-абсорбционный анализ, ИОХ, а также ионный анализ с ионно-селективными электродами. Как показывают некоторые примеры, результаты, полученные различными методами анализа, в пределах известных допустимых отклонений совпадают. Определение щелочных и щелочноземельных катионов в байкальской воде показано на рис. 52.

Рис. 52. Разделение катионов в воде, взятой с поверхности озера Байкал.

Условия: прибор КЭ: Millipore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 54/60 см; поле: 446 В/см; буфер — 5 мМ имидазол/серная кислота, pH 4.5; ввод пробы гидростатический, 30 с. Непрямое детектирование, 214 им. Проба — байкальская вода: 1 — калий, 2 — натрий, 3 — кальции, 4 — магний. Количественные результаты приведены в таблице 20.

Для подтверждения полученных результатов эти же пробы воды изучали методами ИОХ, а также атомно-абсорбциомной спектроскопии (ААС).

При этом в методе ИОХ анализ пробы проводили по циклической схеме с применением синтетического ионита с детектором по электропроводности, а анализы методом ААС — по стандартному методу Шинкеля. Между найденными концентрациями ионов наблюдалось хорошее согласие.

В качестве другой пробы, для которой имелись в наличии контрольные данные, полученные другими аналитическими методами, изучали воду из лесного родника. Для минеральной воды лесного источника результаты анализов, полученные всеми тремя методами, приведены в таблице 20. Дополнительно здесь же приведены концентрации ионов, имеющиеся на этикетке бутылок с этой водой.

Более проблематичен анализ катионов в крови. Размеры красных кровяных шариков составляют 7:5x2 мкм и граничат с размерами частиц, которые можно вводить в КЭ без проблем. После разжижения свежей крови в 100 раз эта проба уже не в состоянии коагулировать. Красные и белые кровяные тельца крови не допускают прямого ввода пробы в методе ВЭЖХ. Содержание белков в этих разжиженных растворах всегда выше 0.7 г/л, так что белки составляют существенную часть пробы. Несмотря на это, разделение катионов методом КЭ вследствие их очень высокой подвижности по сравнению с компонентами пробы не представляет большой проблемы.

Вследствие высокой чувствительности, детектирование ионов удается провести даже в таком разжиженном растворе. Значения концентраций, определенные по сравнительному методу с внешней сравнительной кривой, соответствуют литературным данным. Для калия найдено значение 6.8 мг-экв/л (литературное значение 5 мг-экв/л), для натрия — 147 мг-экв/л (литературное значение 150 мг-экв/л), для кальция — 3.4 мг-экв/л (литературное значение 2 мг-экв/л) и для магния — 5.4 мг-экв/л (литературное значение 3 мг-экв/л).

Рис. 53. Разделение разжиженной пробы крови.

Условия: прибор КЭ — Milllpore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 50/57 см; поле: 446 В/см, буфер: 5 мМ имидазол/сериая кислота; ввод пробы гидростатический, 30 с, непрямое детектирование 214 им; проба: суспензия 50 мкл крови в 5 мл воды; 1 — калии, 2 — натрий, 3 — кальций, 4 — магний.

Белки в растворе все же нарушают воспроизводимость разделения. На рис. 54 показаны времена миграции и площади пиков кальция для первых восьми вводов пробы.

Рис. 54. Разделение разжиженной пробы крови, характеристические кривые времени миграции/площади пика для проверки воспроизводимости с и без кондиционирования капилляра. Условия аналогичны приведенным на рис. 53.

В результате адсорбции белков, которые при каждом вводе пробы достигают капилляра, силанольные группы на стенках капилляра, ответственные за ЭОП, все более и более блокируются. По этой причине ЭОП замедляется, и ионы движутся к детектору медленнее. Уменьшение скорости движения напрямую отражается на площади пиков. С увеличением времени миграции ионы медленнее проходят через детектор, из-за чего площадь пиков растет. Этим объясняется ход кривых зависимости площади пика от времени миграции, приведенных на рис. 54.

Нормировка площади пика на время миграции является лишь вычислительным приемом с результатами анализа. Однако, причина изменения времени миграции все же остается. Несмотря на это, путем такой нормировки ОСО площади пика уменьшается с 6.2 % до 2.8 %. Приемлемым решением этой проблемы является подготовка капилляра перед каждым пуском. В анализах, описанных до настоящего времени, для кондиционирования капилляра применяли только промывание разделяющим буфером в течение 3 мин.

Для удаления белков из капилляра после каждого разделения во второй серии измерений капилляр сначала промывали в течение 5 минут 0.1 М NaOH и затем 5 минут разделяющим бусрером. Этим способом кондиционирования можно было удалять со стенок капилляра мешающие вещества, внесенные пробой, и в конце концов восстановить свойства капилляра новым буфером. Характеристическая кривая зависимости площади пика от времени миграции в этих случаях не имеет наклона, времена, как и площади пиков, колеблются произвольно. Воспроизводимость площади пика для кальция составляет после 8 вводов пробы 2.0 %. Если площадь нормировать дополнительно на время, это значение составляет 1.5 %.

Амины также могут легко протонироваться, и, так же как ионы металлов или аммония, их можно легко разделять. Типичные значения pKs для алифатических аминов лежат в области от 9.5 до 10.8. На рис. 56 в качестве примера представлено разделение ионов металлов, аминов и аминоспиртов. И в данном случае непрямое УФ-детектирование достигается имидазольной буферной системой. Благодаря высокому разрешению пиков, все вещества, как видно из рисунка, отделены друг от друга на уровне базисной линии.

8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования

Сопоставление нижней границы детектирования (НГД) и верхней границы линейной области удается провести при анализе некоторых аминов, плохо поглощающих в УФ-области. Аналогичные измерения со щелочными или щелочно-земельными ионами провести невозможно из — за их слишком малого УФ-поглощения. Из данных, приведенных в таблице 21, видно, что эта ионы при 200 нм можно детектировать прямым способом. В боратном буфере анализ длится до 5 мин. Непрямым УФ-детектированием при 254 нм с эфедрином в качестве буфера нижняя граница детектирование уменьшается в 50 раз (примерно до 1 мг/л). Линейная область в методе прямого УФ-детектирование распространяется от 1.4 до 1.6 десятичных порядков,