Путешествие в страну микробов - Владимир Бетина

Вирусологи ищут доказательства

При наблюдении в электронном микроскопе соприкосновения бактериофага с бактерией трудно установить, какая часть фага проникает в клетку и что остается снаружи (если остается!). Читатель может справедливо заметить, что рассказ о проникновении ДНК фага в бактериальную клетку и о том, что внешние его оболочки остаются вне этой клетки, является плодом фантазии. Каким же образом доказать то, о чем даже электронный микроскоп не может дать достаточно четкой информации?

В иерархии субмикрокосмоса существуют, однако, еще более мелкие единицы — атомы радиоактивных изотопов (их вирусологи и призывают в подобных случаях на помощь). Молекулы соединений, содержащие такие изотопы, легко отличить от других молекул. Они выделяются своей радиоактивностью, которая измеряется точными и чувствительными приборами.

В 1952 году два исследователя, А. Херши и М. Чейз, одновременно призвали на помощь радиоактивные изотопы: фосфор 32Р и серу 35S. Почему именно эти, а не другие? Да потому, что фосфор встречается только в ДНК бактериофагов, а сера может входить только в состав их белков.

Культуру бактерий выращивали на питательной среде, содержавшей в качестве источника биогенного фосфора исключительно 32Р. Практически бактерии не могут отличить радиоактивный фосфор от обычного и потребляют среду с 32Р. Таким путем атомы с 32Р попадают в бактериальные клетки, которые затем могут стать добычей бактериофагов. И 32Р уже входит в состав ДНК бактериофагов. Подобный опыт повторили в другой пробирке, с радиоактивными соединениями серы 35S, и получили бактериофаги, имеющие в своем белке 35S.

Этими фагами и инфицировали потом бактерии, выращенные в среде, не содержащей радиоактивных соединений. Сначала использовались бактериофаги с радиоактивной серой. Процесс инфицирования был завершен в течение нескольких минут, после чего центрифугированием отделили зараженные бактерии от остатков бактериофага и определили их радиоактивность. У бактерий не было и признаков радиоактивности, тогда как «опустошенные» фаги (головки и хвостовые придатки) проявляли повышенную радиоактивность. Значит, в бактерии проникла из фага только ДНК (не содержащая серы!), в то время как белок, в состав которого входила 35S, остался вне клеток.

Потом последовал опыт с фагами, содержащими в своей ДНК радиоактивный фосфор (белки фагов фосфора не содержат!). Через несколько минут после заражения бактерий остатки фагов и зараженные бактерии были тем же способом разделены и исследованы на радиоактивность. На этот раз она была обнаружена в клетках бактерий! Таким образом, было достоверно доказано, что при поражении бактерий фагами внутрь бактериальных клеток проникает ДНК фага (содержащая фосфор), а снаружи остается его белковая оболочка (содержащая серу).

Бактериофаг как переносчик информации

Из рассказа о бактериофагах, принуждающих клетки бактерий к синтезу ДНК и белкового компонента фагов, мы узнали, что один-единственный фаг может вызвать среди бактерий настоящую эпидемию и за короткий срок уничтожить в жидкой питательной среде миллиарды их клеток.

Но при некоторых обстоятельствах появление бактериофага у микробной клетки не обязательно заканчивается ее гибелью. ДНК из фага проникает в клетку, однако, клетка продолжает жить, как будто бы ничего не произошло. Это напоминает проникновение в команду корабля замаскированных пиратов, которые под видом дружески настроенных матросов тайно подготавливают диверсию, выжидая лишь подходящего момента… Пораженная бактерия продолжает внешне беспрепятственно расти и время от времени в соответствующих условиях делиться на две новые клетки…

Но что-то изменилось в ее свойствах — бактерия приобрела устойчивость к фагам определенного типа. И это является единственным свидетельством того, что в ее клетке находится фаговая ДНК. Специалисты говорят в таких случаях о неинфекционных, или симбиотических, фагах и лизогенных[24] бактериях. «Лизогенных» — потому что в какой-то момент по якобы совершенно непонятной причине 2–3 клетки из миллиарда вдруг расплачиваются за свое гостеприимство и погибают. А из погибших клеток вырываются в среду сотни бактериофагов. Достаточно перенести одну капельку этой среды в другую культуру восприимчивых бактерий, чтобы разразилась катастрофа и почти вся культура в короткий срок погибла.

Почти, но не вся! Некоторые клетки переживут атаку бактериофагов. Но эти счастливчики, перенесшие первый удар, как-то изменятся, приобретут новые свойства и передадут их следующему поколению.

Что же, собственно, при этом происходит? Дж. Ледерберг из Станфордского университета (Калифорния), первый наблюдавший это явление, объясняет его следующим образом. После проникновения фаговой ДНК в лизогенную бактерию обычного размножения фагов не происходит и гибель клетки не наступает. В этом случае фаговая ДНК присоединяется к бактериальной, которая находится в хромосоме клетки. Когда же эта клетка начинает делиться на две дочерние, разделяется и хромосома, причем вдвое увеличивается и количество ДНК из фага и половина ее попадает в каждую из новых хромосом. Итак, при каждом дальнейшем делении клеток фаговая ДНК переносится в каждую из дочерних клеток. Среди миллиардов клеток, естественно, окажутся и такие, в которых фаговая ДНК освободится из хромосомы и начнет бурно размножаться, а клетка погибнет. В некоторых из них ДНК фага захватывает с собой и частичку клеточной хромосомы, и новообразовавшиеся частицы фага содержат в этом случае, кроме собственной ДНК, «кусочек» бактериальной хромосомы. Когда такой фаг встречается с другой восприимчивой клеткой, то вместе с фаговой ДНК в нее попадает частица бактериальной ДНК, и они уже совместно присоединяются к хромосоме новой клетки-хозяина. Фрагмент чужой хромосомы сливается с хромосомой этой клетки, и последняя обогащается, таким образом, новыми генами. Внешне это проявится в приобретении клеткой какого-то нового свойства. Если, например, чужеродный ген определял синтез вещества, которое до этого «обогатившаяся» клетка не могла образовывать, то эту способность получала не только сна сама, но и ее потомство. Приобретенным свойством она обязана гену, попавшему в клетку с помощью бактериофага. Ледерберг назвал такую форму наследственных изменений трансдукцией.

При помощи «бактериофага 80» методом трансдукции удалось перенести свойство устойчивости к пенициллину на бактерию, ранее проявлявшую повышенную восприимчивость к этому антибиотику. Этот же бактериофаг перенес свойство устойчивости и на два других антибиотика, но в данном случае далеко не все «фаги 80» приняли участие в трансдукции, ее осуществлял только один из миллиона.

Могут ли бактерии конъюгировать?

Ледерберг и его старший коллега Тейтем открыли еще одно важное свойство бактерий. Они установили, что кишечные бактерии Escherichia coli имеют половые различия. Одни клетки проявляют характер женских индивидов, другие — мужских. Методом, описанным в следующем разделе, из этих бактерий были выделены два различающихся штамма (мутанта): один из них нуждается в ростовых веществах биотине (Б) и метионине (М), другой — в лейцине (Л) и треонине (Т). Первый штамм ученые стали обозначать формулой Б-М-Т+Л+, а второй — Б+М+Т-Л-, где знак плюс отражает способность, а знак минус — неспособность штаммов синтезировать то или иное ростовое вещество.

Из каждого штамма взяли по 10 миллионов клеток, смешали их и посеяли на агаризованную среду, в которой не было ни одного из упомянутых ростовых веществ. Обычно ни тот ни другой тип бактерий на таком агаре не развивались, так как обоим не хватало по два ростовых вещества. И тем не менее на агаре появилось около ста колоний. Чем это объяснить? Исследования Ледерберга и Тейтема показали, что в разросшихся колониях все бактерии были нового типа (Б+М+Т+Л+). По-видимому, некоторые клетки из обоих штаммов конъюгировали между собой, причем мужская клетка передала женской клетке часть своей хромосомы, именно ту ее часть, в которой были гены, определяющие способность синтеза двух ростовых веществ, ранее не вырабатывавшихся «женской» клеткой. Теперь она стала самостоятельной и, получив в своей хромосоме два новых гена, приобрела возможность образовывать все четыре ростовых вещества.

Несколько позднее с помощью электронного микроскопа было установлено, что при конъюгации (как назвали этот процесс Ледерберг и Тейтем) две бактерии действительно соединяются друг с другом «копуляционным мостиком» (фото 52). При этом мужская клетка отдает часть своей хромосомы женской клетке.