Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века - Максим Франк-Каменецкий

Хорошо, с Н-связями разобрались, ну а как же быть с линейной зависимостью температуры плавления от Г•Ц-содержания? Ведь если стабильность определяется стэкинг-взаимодействиями, которые разные для разных контактов, то наряду с линейным членом должен быть квадратичный член, а его нет, согласно эксперименту. Кажется, Эйнштейн как-то сказал, что Природа не злонамеренна, но коварна. Это тот самый случай, когда проявилось коварство Природы: она как будто нарочно ввела нас в заблуждение о том, какие силы стабилизируют «самую главную молекулу». Если предположить, что различные нуклеотиды распределены вдоль ДНК случайным образом, вычислить в этом предположении коэффициент при квадратичном члене и подставить значения стэкинг-взаимодействий, полученные нами в опытах с короткими ДНК, содержащими ник, то этот коэффициент получится практически равным нулю. Иными словами, стэкинг-взаимодействия для разных контактов таковы, что температура плавления ДНК со случайной последовательностью должна строго линейно зависеть от Г•Ц-содержания, т. е. имитировать ситуацию, будто водородные связи, а не стэкинг-взаимодействия определяют стабильность двойной спирали. А поскольку данные о температурах плавления были получены для бактериальных геномов, в которых нет мусорной ДНК, в отличие от эукариот (о мусорной ДНК речь пойдет в главе 12), то предположение о случайном распределении нуклеотидов вполне реалистично, как реалистично предположение о случайности распределения букв в осмысленном лингвистическом тексте.

Ну и последнее. Если дело не в том, что у Г•Ц-пары три Н-связи, а у А•Т-пары две, то как объяснить рост температуры плавления с Г•Ц-содержанием ДНК? Очень просто. Согласно нашим данным, стэкинг-взаимодействия для контактов, содержащих Г•Ц-пары, сильнее, чем для контактов, состоящих только из А•Т-пар. Этим и объясняется рост температуры плавления с увеличением Г•Ц-содержания ДНК, а вовсе не тем, что у Г•Ц-пары больше Н-связей, чем у А•Т-пары.

Такой поворот на 180 градусов в фундаментальных научных представлениях принято называть сменой парадигмы. Обычно научная общественность реагирует весьма болезненно на подобные резкие повороты. Но странным образом с нашей работой такого не произошло: нам без проблем удалось опубликовать наши результаты в ведущих профессиональных журналах, и эти статьи очень интенсивно цитируются в научной литературе. По-видимому, приведенные выше аргументы оказались для научной общественности вполне убедительными.

Z-форма

Как мы уже говорили, Уотсон и Крик, а также их последователи, занимавшиеся моделированием структуры ДНК, опирались на данные по рассеянию рентгеновских лучей от волокон ДНК. Это были именно волокна, а не кристаллы, так как естественные, выделенные из клеток молекулы ДНК не кристаллизуются. Причина этого понятна – молекулы ДНК слишком длинные, чтобы из них можно было получить кристалл.

Определенная упаковка молекул при частичном высушивании раствора происходит – они укладываются подобно бревнам в запани (на лесосплаве), только не в двух измерениях, как на поверхности воды, а в трех. Промежутки, как и в запани, заполнены водой. Рассеяние рентгеновских лучей от подобного частично упорядоченного расположения молекул дает довольно богатую информацию, но недостаточную для однозначного восстановления структуры молекул, исходя только из рентгенограмм. Это обстоятельство и явилось причиной долгих споров о том, правильно ли Уотсон и Крик «угадали» структуру ДНК в волокнах.

После опытов Уонга, а также Шора и Болдвина создалась в определенном смысле парадоксальная ситуация. Стало ясно, что в растворе изолированные молекулы ДНК имеют структуру, в своих основных чертах соответствующую модели Уотсона—Крика. А в волокнах, в условиях возникновения взаимодействия между молекулами? Не изменяется ли структура? Специалисты, занимающиеся моделированием ДНК и расчетами того, как происходит рассеяние рентгеновских лучей от этих моделей, убеждали, что только В-форма ДНК может дать наблюдаемую картину. Но могли оставаться сомнения, не упустили ли они из виду что-либо.

Проблема была бы решена, если бы удалось все же получить кристаллы из ДНК, исследовать рассеяние рентгеновских лучей от этих кристаллов, а потом строго решить обратную задачу восстановления структуры по картине рассеяния. Именно так определяют пространственное строение обычных химических соединений любой сложности, а также белков. Но для ДНК это сделать не удавалось.

Ясно, что для длинных молекул или для коротких молекул, имеющих разную длину или разную последовательность, нет шансов получить кристаллы. Надежда была на то, что если взять короткие молекулы, содержащие около 10 пар оснований и имеющие одинаковую длину и последовательность, то их удастся как-то закристаллизовать.

Но получение кристаллов – это весьма кропотливое дело. Нужно варьировать маточный раствор, из которого ведется кристаллизация, так что требуются очень большие количества вещества. А где взять много кусочков ДНК строго заданной длины? Такие препараты стали доступны только в конце 1970-х годов благодаря потрясающим успехам в химическом синтезе ДНК с заданной последовательностью.

Успехи химиков в этой области действительно поражают. В свое время синтез Кораной троек нуклеотидов разной последовательности вызвал сенсацию и в конечном счете принес автору Нобелевскую премию. (Как, возможно, помнит читатель, эти тринуклеотиды позволили провести полную расшифровку генетического кода, см. главу 2.) К началу 1980-х годов стало возможным заказать небольшой ящик размером с пишущую машинку. На ящике кнопки с буквами А, Т, Г, Ц. Вы нажимаете кнопки в том порядке, какую вы хотите получить последовательность (но не более 20 нуклеотидов), засыпаете в ящик исходные ингредиенты, также выпускаемые промышленностью, и идете обедать. Потом вы можете сходить в библиотеку или на семинар, а вернувшись через несколько часов, обнаружите в выходном устройстве вашего ящика несколько миллиграммов препарата, который вы заказали. Но в последние годы народ совсем обленился. Теперь эти чудо-приборы пылятся на полках или, скорее всего, вообще выброшены на свалку, а кусочки ДНК нужной последовательности заказывают по Интернету на одной из множества фирм по смехотворной низкой цене.

Так или иначе, больше не существует проблем, связанных с искусственным синтезом гена. Из синтетических олигонуклеотидов можно при помощи лигазы сшить ген любой длины. Это решает также проблему получения в больших количествах коротких кусков ДНК для их кристаллизации. Впрочем, машины, синтезирующие куски ДНК, появились в самом начале 1980-х годов, но в конце 1970-х в некоторых лабораториях, занимавшихся синтезом генов, уже умели быстро синтезировать лоскутки ДНК, правда, вручную.

Впервые хорошие кристаллы маленьких кусочков ДНК удалось получить в 1979 году в лаборатории Александра Рича (Массачусетский технологический институт). Кристаллы были из гексануклеотидов:

Каково же было удивление Рича и его сотрудников, когда, проделав все необходимые очень трудоемкие процедуры, они получили наконец структуру своих кусочков. Эта структура не имела ничего общего с моделью Уотсона и Крика!

Нет, разумеется, у нее были нормальные пары ГЦ, и даже кусочек образовывал отрезок двойной спирали, но на виток спирали приходилось не 10, а 12 пар оснований. Но главное не это. Главное, что спираль была не правая, как в В-форме, а левая!

Имелся еще целый ряд принципиальных отличий этой новой структуры, названной авторами Z-формой, от В-формы ДНК. Название происходит от того, что, в отличие от В-формы, в которой сахарофосфатный остов образует плавную винтовую линию, в Z-форме эта линия имеет зигзагообразный вид (рис. 41).

Что же получается, неужели все-таки модель Уотсона—Крика оказалась в конечном счете неверной? Ведь первая же структура ДНК, найденная с помощью абсолютно надежных методов рентгеновской кристаллографии, оказалась принципиально отличной от В-формы.

Нет, открытие американских ученых при всей своей сенсационности не носит столь радикального характера. Опыты с кольцевыми ДНК однозначно свидетельствуют о том, что спираль ДНК в растворе правая и на виток спирали приходится 10 пар, что соответствует В-, а не Z-форме. Так что же, значит, в кристалле вследствие межмолекулярных взаимодействий структура двойной спирали столь сильно меняется? Нет, дело и не в этом.

Как удалось установить, тому, что изученный гексануклеотид оказался в Z-форме, способствовала главным образом строго чередующаяся последовательность Г и Ц.

Вскоре Р. Диккерсон и его сотрудники из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе определили структуру в кристалле ДНК другой последовательности:

Оказалось – В-форма. Стали изучать переход ДНК в Z-форму в растворе. Выяснилось, что при обычных условиях, по крайней мере в линейной ДНК, Z-форма не образуется. Ну а в сверхспирализованной?