Нейротон. Занимательные истории о нервном импульсе - Александр Иванович Волошин

По серии электронных микрофотографий послойных срезов тела червя была построена модель коннектома, правда некоторые «белые пятна» всё же были восполнены методом экстраполяции.

Полученные сетевые карты можно изучать методами теории графов. Весь коннектом нематоды был представлен как граф из 579 узлов, в узлах которой расположены нейроны, мышечные или другие возбудимые клетки. Ребра, соединяющие вершины такого графа – это синапсы, причём, их число также чётко фиксировано у всех особей, в данном случае мужского пола.

Но кроме микроконнектомики продолжают развиваться исследования связей между разными структурами мозга – «региональная коннектомика».

Для этого есть несколько методов, самый популярный из них – трактография, с помощью которой определяют ход пучков нервных волокон и моделируют картину связей между разными областями живого мозга.

Рисунок 27 Коннектом мужской особи нематоды

Исследования в области коннектомики ведут несколько проектов, один из крупнейших – Human Connectome Project. Он был запущен в 2009 году, рассчитан на пять лет, а финансировался Национальным институтом здравоохранения США. В проекте участвовало 1200 взрослых добровольцев.

Для каждого из участников средствами магнитно-резонансной томографии были составлены карты анатомических и функциональных связей мозга, а к 2018 году планировалось полное секвенирование их геномов.

Коннектомика уже сейчас изменяет наши взгляды на психические заболевания. Есть предположение, что многие из них, по сути своей – коннектопатии, связанные с нарушением связей, а не с патологиями тех или иных структур или областей мозга.

Когнитом

Ещё не создан коннектом человека, но мысли и фантазии уносят нас вперёд.

Где хранятся наши врождённые способности дышать, есть, двигаться и чувствовать? Заложены они уже в структуре нервной системы или записаны поверх неё? Наконец, где и как записываются и хранятся наши приобретённые социальные навыки, например, речь и вершина всего – самосознание.

Так родилась идея когнитома.

(Когнитивность, от латинского cognitio, «познание, изучение, осознание», – способность к умственному восприятию и переработке внешней информации.)

«Когнитом в нашем понимании, – рассказывает автор теории Анохин Константин Владимирович, – это весь набор когнитивных элементов мозга, которые составляют нашу личность. Мы полагаем, что каждый из этих элементов представлен в мозге, в нашем коннектоме, в виде функциональной системы. И в этом основная сложность исследования когнитома. Когнитивная единица не лежит на полочке той или иной структуры мозга, каждая из них – это распределённая сеть клеток, причём клетки одной структуры могут входить в самые разные элементы субъективного опыта. А каждый элемент субъективного опыта – масса синхронно активируемых в определённый момент нейронов в разных областях мозга. Элементы когнитома, так же, как и весь когнитом, – это не статическая картина, это постоянно развивающаяся система. В результате нового опыта, обучения в эту сеть добавляются те или иные новые элементы, меняющие как структуру когнитома, так и связи между уже существующими элементами».

Как можно обнаружить эти когнитивные единицы? Как выделить среди миллиардов нейронов мозга группу, отвечающую за элемент субъективного опыта, найти материальный носитель воспоминания, представления, навыка?

Оптогенетика

Оптогенетика – новомодная методика исследования работы нервных клеток, основанная на внедрении в их мембрану специальных каналов – опсинов, реагирующих на возбуждение светом. Давно известно, что нервные клетки способны реагировать на механические, химические, электрические раздражители. Теперь после сложных генетических манипуляций наконец-то нейроны можно заставить возбуждаться светом с определённой длиной волны.

Для создания светочувствительных каналов в мембране задействованы методы генной инженерии. А для возбуждения модернизированных нервных клеток и сетей в ход идут лазеры, световоды и прочая оптическая аппаратура.

На рубеже ХХ века казалось – вот он ещё один прорыв в исследовании нейронов. На практике же очередная игрушка в руках нейробиологов. Демонстрация великолепных научных успехов, но в совсем другой отрасли биологии – генетике.

Брэйнбоу

Более интересное применение оптогенетике нашли американские исследователи Медицинской школы Гарварда под руководством Джеффа В. Лихтмана (Jeff W. Lichtman) и Джошуа Р. Сейнса (Joshua R. Sanes). Они заставили нервные клетки светиться в момент прохождения по ним нервного импульса. Этот метод позволил лучше следить за взаимодействием групп нейронов в мозге.

Исследование опубликовано в журнале Nature Communications [33] в ноябре 2007 года. В статье описывались техники экспрессии флуоресцентных белков в генетически модифицированных животных под названием «Брэйнбоу-1» и «Брэйнбоу-2». Техника «Брэйнбоу-3» была представлена в 2013 году. Название метода происходит от сочетания английских слов brain (мозг) и rainbow (радуга).

Каким образом проводят генную модификацию живых тканей? Чтобы вставить фермент в клетки мозга, учёные соединили его с вирусом, который мог «заражать» нейроны.

Оказалось, что, будучи внедрённым в геном животного, зелёный флуоресцентный белок и его генетически модифицированные варианты могут окрашивать нервные клетки в разные цвета (до 100 разных оттенков), что позволяет значительно точнее и гораздо красивее картировать нейронные связи.

Ещё в конце 19-го века Камилло Гольджи со своей «Чёрной реакцией» впервые в истории визуализировал нейроны. В 1960-х годах И. Тасаки применил красители, флуоресцирующие при электрической стимуляции нейронов «для наблюдения за физическими изменениями в нервных мембранах при передаче импульсов». Целью современных исследователей было улучшение традиционных методов нейровизуализации, поскольку предыдущие техники имели серьёзные ограничения, в первую очередь связанные с небольшим количеством цветов, доступных для окрашивания индивидуальных нейронов.

Свечение индивидуальных нейронов создаёт потрясающий фронт работы – можно выявить мельчайшие особенности морфологии каждого нейрона и даже проследить путь индивидуальных аксонов и дендритов. Всё вместе это дало возможность для полноценного картирования структуры нейронных цепей мозга. А заодно превратило фотографии гистологических препаратов в настоящее арт объекты!

Прозрачный мозг

Нервную систему нематоды (C. elegans) было легко исследовать благодаря прозрачности последней. А, например, мозг мыши, в отличие от этого червячка, велик и непрозрачен.

Основную массу мозга составляют липиды клеточных мембран и миелинового покрытия нейронов, а также глии. Плотная липидная составляющая мозга слабопрозрачна для света – даже двухфотонная лазерная микроскопия, созданная для визуализации глубоких слоёв живых тканей, способна заглянуть вглубь мозга лишь на 800 мкм. Львиная доля гистологических исследования нервных тканей до недавнего времени была обречена начинаться с фиксации и изготовления срезов.

Поэтому исследователи разработали метод, позволяющий буквально прояснять мозг мыши – делать его прозрачным.

Одним из «отцов» нового метода, названного – CLARITY (англ. «ясность») и описанного в 2013 году, является Карл Дейссерот. Технология позволяет свету проходить сквозь ткань и делает её доступной для микроскопа.

Технология CLARITY основана на идее: убрать из ткани основной компонент, который мешает прохождению света – липиды. Попытка просто растворить мембраны без предварительной подготовки приводила к тому, что содержимое клеток вываливалось из них наружу. Чтобы этого избежать, препарированный мозг зафиксировали формальдегидом для фиксации и удержания на своих местах белков и нуклеиновых кислот, а затем насытили раствором мономеров геля-носителя, призванного играть роль «матрицы», после чего запускалась реакция полимеризации. В результате ткани мозга оказались буквально слиты с прозрачным гелем-носителем. Затем блок с мозгом, а точнее – тканево-гелевым гибридом, – подвергают электрофорезу в присутствии ионного детергента (SDS). В течение нескольких дней движимые электрическим полем мицеллы SDS протискиваются через тканево-гелевый гибрид, «вымывая» из него липиды. На выходе получается практически прозрачный блок, пригодный для оптической и флуоресцентной микроскопии. Однофотонная микроскопия позволяет исследовать такой препарат на глубину 3,6 мм, а не на 50 мкм, как в случае с естественным «непрозрачным» мозгом.

Рисунок 28 Технология CLARITY [28]

На картинке – изящная иллюстрация действия метода «опрозрачивания» тканей. Один и тот же мышиный мозг до (слева) и после (справа) обработки этим методом лежит на цитате великого Сантьяго Рамона-и-Кахаля: «Мозг – это целый мир со множеством неизведанных континентов и белых пятен на карте».

Применение CLARITY в сочетании с флуоресцентным окрашиванием позволяет получить чёткую трёхмерную картинку. Сегодня эта технология широко используется