Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века - Максим Франк-Каменецкий

Рис. 24. Повторы, обнаруженные Атсуо Накатой с сотрудниками в геноме кишечной палочки. Ясно видно, что последовательность из 29 нуклеотидов (подчеркнуто) строго повторяется 14 раз, в то время как между промежуточными последовательностями, содержащими от 32 до 33 нуклеотидов, нет ничего общего

Это было поворотным моментом. К изучению системы КРИСПР подключился крупнейший американский биоинформатик российского происхождения Евгений Кунин, который углубил и расширил анализ последовательностей. Были выявлены кодирующие белки гены, участвующие в КРИСПР, получившие название «кас». Большой вклад в изучение проблемы внес российско-американский микробиолог Константин Северинов. Затем подоспели молекулярные биологи, которые довольно быстро разобрались в деталях того, как осуществляется иммунная реакция.

А происходит следующее (рис. 25). Вся кассета КРИСПР транскрибируется. Получившаяся РНК нарезается на куски, каждый из которых содержит один повтор и один промежуток. Такая небольшая молекула РНК, содержащая около 60 нуклеотидов, обозначается как крРНК. Ген кас экспрессирует кас-белок, который связывается с крРНК и начинает внимательно обследовать двунитевую ДНК в клетке. Белок локально раскрывает двойную спираль и примеряет к раскрытому участку крРНК. Когда происходит комплементарная гибридизация между крРНК и одной из цепей ДНК, кас-белок режет обе цепи ДНК, создавая двунитевой разрыв двойной спирали. Такой разрыв ведет к деградации ДНК в бактериальной клетке. Вторгшаяся в клетку плазмидная или фаговая ДНК обезврежена.

Почему же комплекс крРНК с кас-белком не набрасывается на саму кассету КРИСПР и не производит разрыв геномной ДНК бактерии? Для этого существует специальная, очень короткая последовательность, которая присутствует в ДНК фага или плазмиды и узнается кас-белком, но которая отсутствует в кассете КРИСПР. В отсутствие этой последовательности кас-белок не работает.

Таким оказался механизм приобретенного иммунного ответа бактерий. Да, остается только признать: в эклектическом буйстве жизни, с которым нам приходится иметь дело, нашлось место и Ламарку. Но громадный интерес, который привлекает к себе обнаруженный у бактерий иммунитет, связан не с частичной реабилитацией ламаркизма, а с практическими приложениями системы КРИСПР-кас в области редактирования генома в живой эукариотической клетке, о чем речь пойдет в главе 11.

Рис. 25. Механизм приобретенного иммунитета у бактерий (КРИСПР). КРИСПР-кассета состоит из повторов (белые участки) и промежутков 1, 2, 3,4… n. В случае кишечной палочки n = 13 (см. рис. 24). За КРИСПР-кассетой следуют гены, кодирующие кас-белки. Вся кассета транскрибируется и затем нарезается на отдельные крРНК, каждая из которых несет только одну промежуточную последовательность. Кас-белок связывает одну из крРНК, локально раскрывает двойную спираль вторгшейся ДНК, и когда происходит гибридизация между крРНК и участком вторгшейся ДНК, кас-белок наносит два однонитевых разрыва в обеих цепях раскрытой области двойной спирали: инфекция блокирована

7

Кольцевые ДНК

ДНКовые кольца

Внимательный читатель, должно быть, заметил, что для понимания биологических функций ДНК важны два ее основных свойства: она состоит из двух комплементарных цепей, и генетическая информация заключена в последовательности нуклеотидов четырех типов (А, Т, Г и Ц). Собственно, на этих двух фактах зиждется все стройное здание современной молекулярной биологии, включая генную инженерию. Даже то, что ДНК – это спираль, а не просто веревочная лестница, биологам знать как бы ни к чему, а уж генным инженерам – и подавно, не говоря уже о более тонких деталях физического строения молекулы. Во всяком случае есть люди, которые действительно так считают. Эти люди говорят, что хватит, мол, копаться в этой ДНК, пора всем дружно взяться только за сугубо практические задачи, для решения которых вполне достаточно того, что известно.

Конечно, позиция эта недальновидна. То, о чем было рассказано в предыдущих главах, убеждает, что при изучении ДНК даже самые, казалось бы, пустяковые факты могут привести к открытиям первостепенной важности. Вспомните историю открытия рестриктаз. Ведь все началось с выяснения очень тонкой химической особенности молекул ДНК – метилирования ничтожной доли нуклеотидов. Эта особенность не была связана с основными функциями ДНК, а лишь позволяла клетке отличать «свои» молекулы от «чужих». А где были бы сейчас молекулярная биология и генная инженерия, не будь открыты рестриктазы?!

Так кто же осмелится утверждать, что тщательное изучение структуры ДНК не откроет нам совсем новые характеристики молекулы, важные для ее работы, не выявит новые ферменты, о которых никто раньше и не подозревал? Где гарантия, что в результате мы не сможем еще активнее вмешиваться в генетические процессы? Вновь и вновь мы убеждаемся в том, что изучение биологической роли тонких особенностей структуры ДНК обещает интересные и неожиданные находки. Пожалуй, самое яркое свидетельство тому – открытие кольцевой формы ДНК, явления сверхспирализации и ферментов топоизомераз. При выяснении возникших здесь вопросов молекулярным биологам в наибольшей степени потребовалась помощь со стороны физики и математики.

Когда научились выделять из клеток молекулы ДНК (а биохимики овладели этим искусством очень давно), то вскоре убедились, что эти молекулы ведут себя так, как и положено себя вести обычным линейным полимерам. На каждую молекулу приходилось по два конца. И ни у кого не вызывало сомнений, что все молекулы ДНК – линейные цепи. Правда, генетикам часто было неясно, какие же гены считать концевыми. Поэтому им приходилось рисовать свои генетические карты в виде кольцевых диаграмм. Но можно себе представить, как посмеялись бы над тем чудаком, который стал бы утверждать, что эти условные кольцевые карты отражают истинное кольцевое строение самих молекул! Для того, чтобы всерьез утверждать такое, надо было доказать, что молекулы ДНК и впрямь бывают кольцевыми. Как это часто случается, ответ пришел оттуда, откуда его и не ждали.

Электронные микроскописты изучали маленькие ДНК онкогенных вирусов, т. е. вирусов, вызывающих рак. Генетические сведения об этих ДНК практически вообще отсутствовали, но работать с ними было удобно – маленькие ДНК не рвутся на куски, как это происходит с длинными молекулами, выделять которые в неповрежденном виде – очень трудная задача. Так вот, к величайшему удивлению своему, микроскописты обнаружили, что некоторые вирусные ДНК замкнуты в кольцо. Это наблюдение было сделано в начале 1960-х годов. Стало ясно, что кольцевые генетические карты – штука вовсе не случайная.

Однако особого интереса открытие не вызвало. Мало ли какой бывает ДНК в вирусах! Иногда она находится там в виде одной из двух комплементарных цепей. Порой эта цепь замкнута в кольцо. Но заведомо известно и много случаев, когда внутри вирусной частицы ДНК линейна.

Все же поиск кольцевых ДНК продолжался. И постепенно выяснилось, что даже в тех случаях, когда ДНК в вирусной частице линейна, она, как правило, замыкается в кольцо после проникновения вируса в клетку. Оказалось, что перед началом репликации такая линейная молекула переходит в форму (ее называют репликативной), в которой обе комплементарные цепи ДНК образуют замкнутые кольца (рис. 26). Кольцевыми оказались ДНК бактерий, в частности, кишечной палочки. Плазмиды, эти незаменимые в генной инженерии переносчики генов, всегда кольцевые. Короче, трудно назвать случаи, когда ДНК работает в прокариотической клетке, не находясь в кольцевом состоянии. Отметим сразу, что у эукариот хромосомная ДНК всегда линейна. Мы еще вернемся к этому фундаментальному различию между двумя основными царствами живых существ. А пока сосредоточим свое внимание на прокариотах. Зачем прокариотической клетке замыкать молекулы ДНК в кольца? Что это дает? К каким изменениям свойств молекул приводит? Чтобы ответить на эти вопросы, надо было подробно изучить эту новую форму ДНК.

Рис. 26. В замкнутой кольцевой ДНК две комплементарные цепочки образуют зацепление высокого порядка

Сверхспирализация и топоизомеразы

Для нас сейчас важнее всего то, что в молекуле ДНК комплементарные цепи обвивают друг друга подобно двум лианам, и когда каждую из цепей замыкают, то два кольца оказываются зацепленными так, что их невозможно развести. Простейшее зацепление двух колец известно всем – это символ бракосочетания (рис. 27). Только две комплементарные цепи в ДНК сцеплены друг с другом гораздо сильнее.

Количественно степень зацепленности двух колец характеризуется величиной, называемой порядком зацепления и обозначаемой Lk (от английского слова linking). Определить эту величину для любого зацепления очень легко. Нужно представить себе, что на одно кольцо натянута мыльная пленка, и подсчитать, сколько раз второе кольцо протыкает эту пленку. Тогда легко убедиться, что для символа бракосочетания Lk = 1, а для зацепления, изображенного на рис. 26, Lk = 9.