Антибиотики и химиотерапевтические препараты - Алексей Сизенцов

При селекции наиболее активных штаммов продуцентов ряда антибиотиков, выделенных из естественных мест их обитания, используют антибиотики. Например, для выделения из почвы наиболее активных штаммов продуцента стрептомицина в агаровую среду, используемую для их высева, добавляют определенную концентрацию стрептомицина. Штаммы Str.griseus, образующие большие количества антибиотика, способны выдерживать такую концентрацию стрептомицина и нормально развиваться в его присутствии. Менее активные штаммы не приспособлены к высоким концентрациям стрептомицина и в его присутствии не развиваются.

В питательную агаровую среду вносят стрептомицин в количестве 100 мкг/мл субстрата, а затем высевают выделенные штаммы актиномицетов, относящиеся к Sir.griseus. В результате культуры, чувствительные к этой концентрации стрептомицина, не давали развития примерно в 80 % случаев. Остальные 20 % штаммов, среди которых были и довольно активные, вырастали на этой среде. Приведенный метод оказывается полезным при первичном исследования почвенных культур актиномицетов.

Однако методы выделения наиболее активных форм, получающихся в результате естественной изменчивости, не дают значительного повышения образования антибиотиков.

Решающим приемом, обеспечивающим успех селекции многих продуцентов антибиотиков, является метод получения мутаций под влиянием сильнодействующих факторов – рентгеновских и ультрафиолетовых излучений, некоторых химических соединений (азотистой формы иприта др.). При действии таких факторов в течение определенного периода времени происходит полная гибель микроорганизмов. Однако можно подобрать экспозицию (концентрацию) и силу воздействия, при которых часть клеток или спор изучаемого вида может выжить.

У таких переживших микроорганизмов особенно под влиянием сильнодействующих факторов, могут появляться формы с измененным характером отдельных звеньев обмена веществ, а так же варианты с измененными свойствами. Наряду с формами, потерявшими способность образовывать антибиотик, а их обычно бывает большинство, появляются такие, у которых обнаруживается значительное повышение антибиотикообразования.

Выявление высокоактивных штаммов осуществляется теми же методами, которые используются и при отборе вариантов, возникающих в результате естественной изменчивости.

Довольно часто в селекционной работе применяют последовательное воздействие на организм различных факторов. В результате применения различных методов селекции удалось значительно (от 50 до 100 и более раз) увеличить образование таких важных антибиотиков, как пенициллин, стрептомицин, антибиотики тетрациклиновой группы и др. (таблица 3).

Таблица 3 – Результат селекции продуцентов некоторых антибиотиков (по Захарову и Квитко, 1967)

Существенное значение в селекционно-генетической работе имеет выход образующихся мутации, который зависит от применяемого мутагена, его концентрации, времени воздействия, а также от свойств самого организма. При селекции наиболее активных штаммов продуцентов антибиотиков необходимо иметь в виду, что частота морфологических мутации микроорганизмов не всегда совпадает с частотой биосинтетических мутаций.

Иногда при селекции продуцентов антибиотиков, относящихся к плесневым грибам, используют анастомозные культуры, т.е. культуры, полученные в результате соединения двух развивающихся конидий перемычками, анастомозами. Образовавшиеся таким образом гибридные формы продуцента пенициллина при действии на них ультрафиолетовых излучений или этиленимина дают большую частому изменчивости.

В результате использования анастомозных штаммов гриба Реnicillium и при обработке их ультрафиолетовым излучением или этиленимином был получен вариант «новый гибрид», образующий в соответствующих условиях культивирования до 5000 единиц пенициллина.

Селекцию актиномицетов-продуцентов антибиотиков проводят, преследуя разные цели. Так, при селекции продуцента стрептомицина необходимо было получить штамм с высокими биосинтетическими свойствами и как можно меньшей способностью к образованию маннозидострептомицина, значительно снижающего биологическую активность стрептомицина в пересчете на единицу биомассы (мг).

Для получения высокоактивных штаммов продуцентов стрептомицина были использованы различные воздействия на актиномицет. Вначале исходная культура, образующая до 200 мкг/мл стрептомицина, пересевалась на среды, содержащие постепенно увеличивающиеся дозы стрептомицина. Удалось получить штамм, адаптированный к 400 мкг/мл антибиотика. Затем взвесь спор актиномицета в дистиллированной воде подвергалась облучению ультрафиолетовым и рентгеновским излучениями в экспозиции, при которой гибель спор составляла 99 %. Облученная суспензия с 1 % выживших спор высевалась на чашки, и каждая выросшая при этом колония изучалась на образование стрептомицина. В результате этого был выделен вариант актиномицета, образующий до 2000 мкг/мл стрептомицина (таблица 4).

Таблица – 4 Схема селекции высокопродуктивного штамма продуцента стрептомицина (по Dylaney, 1953)

Необходимо отметить, что селекция продуцента стрептомицина более сложна. Хорошие результаты получаются при многократном облучении актиномицета ультрафиолетовым излучением при высокой плотности облучения, доходящей до 10000-20000 эрг/мм2 (летальные дозы). Для повышения выживаемости облученных спор применяется выдержка их на видимом свете. В итоге работ по селекции продуцента стрептомицина удалось получить штаммы, способные образовывать до 6000 мкг стрептомицина в 1 мл среды. В настоящее время получены штаммы продуцентов стрептомицина, пенициллина, тетрациклинов, эритромицина и других антибиотиков, в несколько раз более продуктивные (иногда на порядок выше), чем это было, например, 20 лет назад.

В последние годы при создании новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используется ряд новых приемов, в их числе конъюгация плазмидами, слияние протопластов (даже межвидовых), трансформация хромосомных генов и др. Метод слияния протопластов позволяет получать гибриды промышленных штаммов стрептомицетов, а облучение клеток донора и реципиента дает в этом случае увеличение частоты рекомбинаций. Трансформация протопластов хромосомальной ДНК возможна лишь в том случае, если протопласты заключены в липосомы; при этом методе также возрастает частота рекомбинантов.

Таким образом, при использовании различных методов селекции имеется возможность значительно повысить биосинтез ценных антибиотических веществ, образуемых плесенями, актиномицетами и бактериями.

3.6 Изучение условий культивирования выделенных штаммов микроорганизмов-продуцентов антибиотиков

Не менее важную роль в увеличении выхода антибиотиков играют условия культивирования – состав среды, аэрация, температура и др. Так, подбор оптимальной среды для каждого полученного в процессе селекции варианта иногда дает возможность увеличить выход антибиотика в 3 и более раза.

Обычно с выделением нового варианта продуцента антибиотика довольно резко меняется его потребность к условиям культивирования: условия аэрации среды, температура культивирования, удлиняется период процесса антибиотикообразования, могут меняться и другие параметры.

При получении нового варианта продуцента антибиотика важно выявить экономический эффект от внедрения его в практику. Иногда увеличение выхода антибиотика от 10 % до 20 % может оказаться экономически невыгодным, если изменившиеся условия культивирования потребуют применения более дорогой среды или более жестких условий регулирования процесса. Следовательно, для увеличения выхода нужных антибиотиков существенную роль играют: селекция наиболее активных штаммов и изучение условий их культивирования.

3.6.1 Сохранение штаммов продуцентов антибиотиков в активном состоянии

Важное значение для промышленного получения антибиотиков, а также для лабораторных исследований продуцентов антибиотических веществ имеют методы поддержания жизнеспособности организмов, позволяющие сохранить их антибиотическую активность на постоянном уровне.

Известно, что микроорганизмы и в особенности актиномицеты легко изменяются при обычных методах их хранения. Причем довольно часто при этом наблюдается полная или частичная потеря антибиотических свойств.

Потеря антибиотических свойств зависит, по-видимому, от того, что мы не умеем в обычных условиях культивирования создать такие условия, которые бы способствовали сохранению организмом его основных физиологических особенностей. Нередко потеря активности наблюдается при культивировании микроорганизмов на богатых по составу средах и при частых пересевах.